２０１１年１２月第８卷第３６期 ・论著・ 针刺督脉对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡 ’和Ｃａｓｐａｓｅ一８蛋白表达的影响 罗文舒，饶晓丹，吴永刚，曹雪梅，于海波，皮敏，杨卓欣 ，刘远声 广东省深圳市中医院针灸科．广东深圳５１８０３３ ［摘要】目的：研究针刺督脉经穴对局灶性脑缺血大鼠脑细胞凋亡和Ｃａｓｐａｓｅ一８表达的调节作用，探讨针刺督脉经穴 对脑缺血的脑保护机制。方法：线栓法制作雄性ＳＤ大鼠大脑中动脉栓塞（ＭＣＡＯ）模型。通过ＴＵＮＥＬ、免疫组化法观 察各组针刺后细胞细胞凋亡和Ｃａｓｐａｓｅ一８表达的变化。结果：大鼠ＭＣＡＯ后大量细胞凋亡，Ｃａｓｐａｓｅ一８表达增加．针 刺督脉组ＭＣＡＯ ２４ ｈ后凋亡细胞数减少，２４ ｈ和７２ ｈ Ｃａｓｐａｓｅ一８阳性细胞数降低。结论：针刺督脉经穴可减少细胞 凋亡。抑制Ｃａｓｐａｓｅ一８的过度表达，这可能是针刺督脉经穴治疗缺血性脑损伤的作用机制之一。 【关键词１针剌；督脉；缺血性中风；凋亡；半胱氨酸蛋白酶一８ 【中图分类号】Ｒ７４２．３ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７３—７２１０（２０１ １）１２（ｃ）一０２１＂０２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ Ｇｏｖｅｒｎｏｒ Ｖｅｓｓｅｌ ｏｎ ｎｅｕｒｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ一８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｅｒｅｂｒ０ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｒａｔｓ ＬＵＯ Ｗｅｎｓｈｕ，ＲＡ０ Ｘｉａｏｄａｎ， Ｕ Ｙｏｎｇｇａｎｇ，ＣＡ０ Ｘｕｅｍｅｉ，ＹＵ Ｈａｉｂｏ，ＰＩ Ｍｉｎ，ＹＡＮＧ Ｚｈｕｏｘｉｎ＊，ＬＩＵ Ｙｕａｎｓｈｅｎｇ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｘｉｂｕｓｔｉｏｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＴＣＭ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８０３３，Ｃｈｉｎａ 【Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｉｎｇ Ｇｏｖｅｒｎｏｒ Ｖｅｓｓｅｌ ｏｎ ｎｅｕｒｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－８ ｅｘ— ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ＭＣＡＯ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｓｕｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｎｅｕ— ｒｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＴＵＮＥＬ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｎｅｕ－ ｒｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ａｆｔｅｒ ＭＣＡＯ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｔ ２４ ｈ ａｆｔｅｒ ＭＣＡＯ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ６ｆ Ｃａｓｐａｓｅ－８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ２４ ｈ ａｎｄ ７２ ｈ ａｆｔｅｒ ＭＣＡＯ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｉｎｇ Ｇｏｖｅｒｎｏｒ Ｖｅｓｓｅｌ ｍａｙ ｒｅｄｕｃｅ ｎｅｕｒｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ一８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＭＣＡＯ ｒａｔｓ．Ｉｔ ｍａｙ ｂｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｉｎｇ ｏｎ Ｇｏｖｅｒｎｏｒ Ｖｅｓｓｅｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｔｏ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ａｃｕｐｕｎｃｔｕｒｅ；Ｇｏｖｅｎｒｏｒ Ｖｅｓｓｅｌ；Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｃａｓｐａｓｅ一８ 缺血性脑血管病是严重危害我国人民健康的疾病【 ，缺 一段。在游离出的ＥＣＡ剪一小１：１，将制备好的尼龙线（直径 血再灌注损伤是其常见的病理过程，细胞凋亡是其重要的病 ０．２０５ ｍｍ）插入ＥＣＡ内，经ＣＣＡ分叉处通过ＩＣＡ至大脑前 理环节。半胱氨酸蛋白酶一８（Ｃａｓｐａｓｅ一８）是介导两条主要凋 动脉（ＡＣＡ），尼龙线插入深度平均为（１８．５￣０．５）ｍｍ，以完全 亡途径的关键性的酶，凋亡信号传递至Ｃａｓｐａｓｅ一８可使之活 阻断右侧大脑中动脉（ＭＣＡ）血供。缺血２ ｈ时向外拉尼龙线 化．从而启动凋亡的级联反应。针灸作为脑梗死的有效治疗 使其球端回至ＥＣＡ内。此时即可恢复右侧ＭＣＡ血供，形成 手段 在其病理过程中可起重要作用。本研究观察针刺督脉 缺血再灌注。 经穴对脑缺血细胞凋亡和Ｃａｓｐａｓｅ一８蛋白表达的影响，探讨 １．３治疗参数 针刺督脉经穴黼保护作用的可能机制。 假手术组和模型组于术后即如针刺组大鼠般固定于针刺 １材料和方法 操作台上２０ ｎｆｉｎ。不做任何治疗，每１２小时１次。针刺对照组 １．１实验动物和分组 和针刺督脉组术后即予针刺，持续时间为２０ｍｉｎ，每１２小时１次。 以ＳＤ大鼠为受试对象，雄性，体重（２００￣３０）ｇ。实验室温 穴位定位参考人民卫生出版社１９９７年第１版《实验针灸学》中 度控制在２２～２８℃之间。将实验动物随机分为假手术组、模 大鼠的百会、风府、气海、关元取穴方法。将大鼠固定，针刺后采波 型组、针刺对照组、针剌督脉组４组，各３０只。 １０ Ｈｚ），电压３～５ ｖ，电流１ ｍＡ，以身体出现轻微颤动为准。 １．２造模方法 １．４取材 实验动物以１０％水合氯醛腹腔麻醉（３５ ｍｇ／１００ ｇ体 受试动物再灌注后３、６、１２、２４、７２ ｈ后处死，每组每个 重），仰卧于手术台，参考Ｋｕｇｅ造模法［３１，局部常规消毒，颈正 时间段处死６只。１０％水合氯醛腹腔过量麻醉，以生理盐水 中切开。先后分离右侧颈总动脉（ＣＣＡ）、颈外动脉（ＥＣＡ）、颈 灌注，再以４％多聚甲醛内固定，取出脑组织，４％多聚甲醛固 内动脉（ＩＣＡ），离断ＥＣＡ的分支，结扎并游离ＥＣＡ主干 定２４—４８ ｈ，转入３０％蔗糖溶液至沉底，石蜡包埋切片备用。 【基金项目】广东省自然科学基金资助项目（Ｎｏ．８１５１８０３３０１０００００２）。 １．５观察指标 通讯作者 １．５．１脑组织凋亡细胞的原位检测（ＴＵＮＥＬ法）切片以１％ ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ巾胃医药弓报２１ ・论著・ 表１ 各组大鼠脑组织凋亡细胞原位检测阳性细胞数（ 蜘。个） ２０１１年ｌ２月第８卷第３６期 注：与假手术组比较，（ Ｏ．Ｏｌ；与组内其他时间段比较，‘ Ｏ．０１；与模型组比较，呱Ｏ．０１ 表２各组大鼠脑组织顶叶皮层Ｃａｓｐａｓｅ一８蛋白表达的平均灰度值（孟±ｓ） 注：与假手术组比较，叩ｌ（０．Ｏ１；与组内其他时间段比较， ０．０５；与模型组比较， ０．０５ 的过氧化氢处理１０ ｍｉｎ。加０．Ｏ１ Ｍ ＴＢＳ １：２００新鲜稀释蛋白 酶Ｋ ３７℃消化１ ｒａｉｎ。每片切片取末端脱氧核糖核酸转移酶 挽救半暗区缺血缺氧的脑细胞，对减轻缺血再灌注损伤具有 重要意义。 （ＴｄＴ）和ＤＩＧ—ｄ—ＵＴＰ各１ １，加入１８ １标记缓冲液中混匀。 甩去片上多余液体后加标记液２０ 】／片。置样品于湿盒中，３７℃ 标记２ ｈ。加封闭液５０ Ｉｘｌ／片，室温３０ ｒａｉｎ，加抗体稀释液 脑梗死后的细胞凋亡的机制非常复杂，Ｃａｓｐａｓｅ家族在 其中发挥了重要作用。凋亡过程虽然可由多种因素启动，但 凋亡通路却相对保守。可分为外源性和内源性凋亡通路，二 者都通过关键的Ｃａｓｐａｓｅ一８蛋白调控凋亡过程［４１。实验表明， 脑梗死后Ｃａｓｐａｓｅ一８蛋白表达水平上升，这一过程与脑细胞 凋亡的发生发展过程基本相符，提示致病因素引起的Ｃａｓ— １：１００稀释生物素化抗地高辛抗体５Ｏ ｌ／片，３７℃反应３０ ｍｉｎ， ＳＡＢＣ（１：１００）５０ Ｉｘｌ／片加至标本片上．３７℃反应３０ ｍｉｎ，ＤＡＢ显 色，脱水、透明、封片，镜检。 １．５．２免疫组织化学染色（ＳＡＢＣ法）检测Ｃａｓｐａｓｅ一８表达： 用Ｃａｓｐａｓｅ～８多克隆抗体进行ＳＡＢＣ免疫组织化学染色，采 用捞片法，每只实验动物每个脑区取４张切片。切片常规脱蜡 至水，３０％Ｈ２０２ １份加蒸馏水１０份混合，室温５—１０ ｍｉｎ以 灭活内源性酶，抗原热修复，滴加兔抗Ｃａｓｐａｓｅ一８多克隆抗 体（１：１００）２０￣Ｃ ２ ｈ，４ｃＩ：过夜，滴加生物素化山羊抗兔ＩｇＧ，室 温２０ ｍｉｎ，滴加链霉素亲和索一生物素复合物（ＳＡＢＣ，ｌ：１００）， 室温下孵育２ ｈ，ＤＡＢ显色，脱水，透明，封片，镜检。 １．６统计学方法 ｐａｓｅ一８水平改变与脑细胞凋亡的病理过程密切相关。 针灸应用于中风急性期治疗，在脑保护方面越来越引起 采用ＳＰＳＳ １ １．０软件对所得数据进行分析，计量资料采用 均数±标准差（ ±ｓ）表示，重复测量的计量资料采用方差分 析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 ２结果 ２．１针刺督脉经穴对脑缺血细胞凋亡的影响 人们的关注四，临床上重视应用督脉和任脉经穴治疗中风病， 取得了很好的疗效［６３。《难经・二十八难》云“督脉者起于下极 之腧，并于脊里，上至风府，人属于脑”，《素问・骨空论》曰督 脉“上额交巅上，入络脑”，明确指出督脉在循行上与脑密切 相关。督脉为阳脉之海，同时与诸经交汇，通过将十四经脏腑 气血上输于脑，以奉养元神，可见督脉对脑功能的正常发挥 具有重要意义。故历代医家多应用督脉经穴治疗中风所引起 的神志障碍、言语肢体功能障碍等。而任脉为阴脉之海，与督 脉共同协调机体阴阳功能。从实验结果可以看出，针刺督脉治 疗在脑梗死２４ ｈ即可减少凋亡细胞数，在脑梗死２４ ｈ和７２ ｈ 即可下调其Ｃａｓｐａｓｅ一８蛋白表达，而针刺任脉经穴亦有类似 实验结果表明，在各观察时间点，相对假手术组，大脑中 动脉栓塞（ＭＣＡＯ）后凋亡细胞明显增多；在ＭＣＡＯ ２４ ｈ后． 针刺督脉组与模型组比较，凋亡细胞数明显减少（Ｐｌ＜０．０１）； 针刺督脉组与针刺对照组比较，凋亡细胞数差异无统计学意 效果，提示针刺督脉治疗脑梗死，可能通过调节Ｃａｓｐａｓｅ一８表达 水平，减少脑细胞凋亡，从而对脑缺血再灌注损伤起脑保护 作用。 ｆ参考文献１ 【１］汪关宝，杨少琴，史影，等．北京市中关村地区心脑血管病病死率及防治 义（尸＞０．０５）。结果参见表１。 ２．２针刺督脉经穴对脑缺血脑组织Ｃａｓｐａｓｅ一８蛋白表达的影响 策略的流行病学研究［Ｊ】．心肺血管病杂志，２０１０，２９￣）：２６１—２６５． ［２】李云鹏，柳胜生，苏旭燕，等．上海市松江区２００１—２００８年脑卒中流行病 学分析【Ｊ１．上海预防医学杂志，２０１０，２２（１）：２２—２４． ［３］Ｋｕｇｅ Ｙ，Ｍｉｎｅｍａｔｓｕ Ｋ，Ｙａｍａｇａｃｈｉ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｎｙｌｏｎ ｍｏｎｏｆｉｌｍｎｅｎｔ ｆｏｒ ｉｎ— 实验结果表明，与假手术组比较，模型组在各时间点Ｃａｓ． ｐａｓｅ一８蛋白表达的平均灰度值降低，提示Ｃａｓｐａｓｅ～８蛋白阳 性细胞数增多，在ＭＣＡＯ １２ ｈ其平均灰度值降至最低点，其 后时间点其平均灰度值又有所升高：在ＭＣＡＯ ２４ ｈ和７２ ｈ， 针刺督脉组与模型组比较．Ｃａｓｐａｓｅ一８蛋白表达的平均灰度 值提高（Ｐ＜０．０５），与针刺对照组比较，平均灰度值差异无统 计学意义（尸＞０．０５）。见表２。 ３讨论 ｔｒａｌｕｍｉｎａｌ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ【Ｊ１．Ｓｔｒｏｋｅ，１９９５，２６ ０）：１６６５． 【４】Ｋｉｓｃｈｋｅｌ ＦＣ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＤＡ，Ｃｈｕｎｔｈａｒａｐａｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａｐｏ２１ＪＴＲＡＩＬ－ｄｅ— ｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＦＡＤＤ ａｎｄ ｃａｓｐａｓｅ－８ ｔｏ ｄｅａｔｈ ｒｅ— ｃｅｐｔｏｒ ４ ａｎｄ ５ ｆＪ】．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０００，１２：６１ １－６２０． 【５１王鹏琴，白丽，蔡虹，等．眼针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织半暗区 Ｃａｓｐａｓｅ一８、Ｃａｓｐａｓｅ一３ ｍＲＮＡ表达的影响［Ｊ】．针灸临床杂志，２０１０，２６ （９）：５ １—５４． 脑细胞对缺血缺氧非常敏感．脑梗死后，梗死灶中心区 以细胞死亡为主，而周边半暗区病理改变以细胞凋亡为主， ２２巾胃医药导报ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ 【６】罗文舒．针灸任督脉治疗中风后尿失禁的临床研究『】Ｊ．广西中医学院 学报．２００９，１２（１）：１２—１４． （收稿日期：２０１１－１０－３１）