基础研究 中国畜牧兽医文摘２０１４年３０卷第ｌｌ期 肉鸡鼠伤寒 沙门 氏菌的分离鉴定及药敏试验 蒋勇军 （扬州市广陵区沙头镇畜牧兽医技术推广服务站，江苏扬州沙门氏菌病是家禽的一种常见病与高发病，给家禽养殖业 化特征。 ２２５１０５） 造成了较大的危害。沙门氏菌感染不仅引起家禽发病死亡造成严 ２．４ ＰＣＲ鉴定 参考相关文献【３ 针对沙门菌肠毒素ｓｔ ｎ基因设计如 重的经济损失，且易污染家禽产品，成为沙门氏菌的携带者。 目前，从家禽和禽产品中分离出沙门氏菌的报道明显多于其它动 下引物，目的片段大小为２ ６０ｂＰ。上游引物Ｐ １：５ 一 ，下游引物Ｐ２：５ 一 物，造成这一结果的主要原因是由于沙门氏菌在被感染的家禽中 ＣＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＧ一３能通过水平传播和垂直传播造成广泛流行，同时，也反映出家禽 ，ＩＧｃＣ℃ＡＡＡＧｃＡＧＡＧＡＧＡＴＩ℃＿３ ；无菌 臼 （ｌ＿墓 柞 模板，ＰＣＲ体系为 的饲养数量十分庞大川。目前，全球已知的沙门氏菌血清型超过 ２５ ｌ，扩增程序：９４℃５ ｍｉｎ；９４℃１ ｍｉｎ、５５ ｏＣ １ ｍｉｎ、 了２ ５００种，分属不同的血清群，不同血清型沙门氏菌的鉴定具有 ７２ ｃｃ ｌ ｍｉｎ，２５个循环；７２℃１０ ｍｉｎ。扩增产物经琼脂糖凝胶 流行病学意义。而与禽类感染密切相关沙门氏菌主要包括引起鸡 电泳检测。结果见图１，所扩增的ＤＮＡ片段大小约为２６０ ｂｐ，和预 白痢或禽伤寒的鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌，引起禽副伤寒多 期片段大小一致。表明分离菌为沙门菌。 种血清型（以肠炎沙门氏菌与鼠伤寒沙门氏菌为代表），以及引 Ｍ １ ２ 起火鸡亚利桑那病的部分血清型０】。雏禽对沙门菌较为易感，感 染后通常具有较高的死亡率。 多年生产实践表明，由于缺乏效果确实的疫苗，因而该病的 预防和治疗主要依赖于敏感抗生素，但由于抗生素在临床的长期 不合理使用导致耐药菌株的不断增多，使得此病防治变得较为困 难。因此，在临床实践中对沙门氏菌分离菌株的耐药情况进行监 测，具有非常重要的意义。 １ 试验背景 ２０１４年１月，在江苏省扬州市沙头镇某肉鸡养殖场饲养的雏鸡 在１５日龄开始陆续出现发病和死亡情况，使用恩诺沙星等药物给 予治疗，疫情有所好转，但未能根治，平均死亡率超过２０％。发病 雏鸡主要表现为体形瘦小、精神萎顿、羽毛松乱、吃料减少或食 欲废绝、排淡黄绿色至绿色稀粪、并粘污肛门周围的羽毛。剖检 图１分离菌株的Ｓｔｎ基因扩增结果 ｉ．ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００；１．阴性对照２．分离茵ｓｔｎ基因扩增条带 病变主要表现为心包炎、肝脾肿大、胆囊充盈，部分鸡只肝脏有 白色结节等。为确诊，找出治疗该次疫情的药物，特进行了本试 ２．５血清学分型 ’ 验。 在洁净的玻片上滴加ｌ滴沙门氏菌属诊断血清（购自宁波天润 生物药业有限公司），将分离菌加入少量灭菌生理盐水中制成浓 ２细菌分离与鉴定 ２．１病料采集与培养 菌液，然后取少量菌液滴到血清中，混合均匀２ｍｉｎ内判定结果。 现场无菌采集发病鸡的心血、肝脏、脾脏、胆囊、胰腺、脑 同时设生理盐水的对照。Ｏ抗原鉴定：用Ａ—Ｆ多价Ｏ血清进行玻 组织、盲肠内容物等病料，无菌操作取待检病料接种分别接种麦 板凝集试验，同时，设生理盐水作为对照，阳性凝集者依次用 康凯琼脂平板、ｓｓ琼脂平板和营养琼脂平板，３７℃培养２４～４８ Ｏ 、Ｏ ９、Ｏ 、Ｏ ８、０ 。、Ｏ 和０ 因子血清进行凝集试验。根 ｈ，结果，从死亡鸡的组织脏器中分离到１株疑似细菌。该分离菌 据试验结果，判定分离菌Ｏ抗原型。Ｈ抗原鉴定：取疑似菌依次用 在麦康凯平板上生长出无色、透明菌落，在ｓｓ平板上生长出无色 Ｈ多价血清进行鉴定，对于阳性者，再用对应的Ｈ复合血清及Ｈ单 透明菌落，部分菌落中心有黑点，在营养琼脂上生长出无色透明 因子血清逐一检查，以确定Ｈ第一相及第二相Ｈ抗原。Ｈ抗原成分 菌落，初步判断为沙门氏菌。 的最后确定均应根据Ｈ单因子血清的检查结果 。 ２．２显微镜观察 结果表明，分离菌与沙门氏菌０ 因子血清发生凝集反应，与 将可疑沙门氏菌单菌落经涂片固定后，置高倍显微镜下观 其他０因子血清不凝集，可以判定该分离菌株属于沙门氏菌Ｂ群。 察，显示分离菌为长短不一、两端钝圆、两极着色、呈直线形的 进一步对Ｈ抗原的检测结果表明，分离菌分别与｝ｎ和Ｈ １、２发生凝 革兰氏阴性细小杆菌，取单菌落接种到ＬＢ液体培养基中，３７。ｃ培 集反应。查阅卡夫曼一怀特沙门菌抗原表，判定该分离菌为鼠伤寒 养１２—２Ｏ ｈ培养后保存备用。 沙门菌。 ２．３生化试验 ２．６药敏试验 挑取纯化好的菌落加入少量灭菌生理盐水中制成浓菌液，以 取分离菌的２４ ｈ纯培养物分别进行糖发酵试验（葡萄糖、乳 糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）、甲基红试验、枸橼酸盐利用试验 麦氏比浊管为对照调整菌液浓度为０．５个单位，将上述菌液均匀涂 与硫化氢试验等，结果表明分离菌株能分解葡萄糖、甘露醇、麦 布在ＭＨ琼脂平板上，分别贴上各种药敏纸片，３７￣Ｅ培养２２～２４ ｈ 芽糖，产酸产气，不利用乳糖和蔗糖，能利用枸橼酸盐，不分解 后观察，用游标卡尺测量抑茵环的直径。参照药敏纸片附带的抑 尿素，甲基红试验阳性，硫化氢试验产生Ｈ ｓ，符合沙门氏菌的生 菌圈直径判断标准，分别记作ｓ（敏感）、Ｉ（中度敏感）、和Ｒ 作者简介：蒋勇军（１９７０－），兽医师，中国农业大学网络学院动物医学本科，扬州市广陵区沙头镇畜牧兽医技术推广服务站长。 ・４６・ 中国畜牧兽医文摘２０１４年３０卷第１１期 基础研究 （耐药）。结果该分离菌株均对头孢噻肟和环丙沙星较为敏感， 沙门菌通过禽产品传播。 目前，抗生素是预防和治疗家禽沙门氏菌感染的主要方法， 对氟苯尼考、卡那霉素、庆大霉素中度敏感，对氨苄西林、头孢 孟多、氯霉素、链霉素、复方新诺明、甲氧苄啶、四环素、氟哌 但其效果受流行菌株耐药性的影响明显。对某一地区流行菌株进 酸具有耐药性。根据上述结果表明，该分离菌属于多重耐药菌 行分离及体外药物敏感性测定是确保药物防治有效性的基础。本 研究发现，分离菌除对头孢噻肟和环丙沙星等少数几种抗生素较 株。 为敏感外，对其它抗生素均存在一定的抗性。由于临床耐药菌株 取分离菌的２４ ｈ纯培养物，经１：１０稀释后肌肉接种７日龄健 的不断增多，给正确选择用药带来了很大难度，往往不能结合药 康雏鸡５只，剂量为０．３ ｍｌ／只，对照组以同样方式注射等量生理盐 敏试验结果给予及时有效的治疗，从而带来很多不必要的经济损 水，与试验组分开饲养。接种后，记录试验鸡临床表现，对病死 失。因此，开展对沙门氏菌分离菌株药物敏感性调查，检测其耐 ２．７动物回归试验 鸡进行病理剖检观察。结果，分离菌株对健康雏鸡具有较强的致 药性的情况具有十分重要的临床指导意义。 病力，攻毒后９６ ｈ内，所有试验鸡全部发病死亡，症状主要表现 参考文献 为全身脱毛、呼吸困难、身体消瘦、水样拉稀等症状。剖检可见 心，肝有明显白色纤维素膜覆盖，气囊混浊；细菌分离，证实为 鼠伤寒沙门菌感染。而对照试验组则全部存活，无异常现象。 ［１］张伟．鸡蛋沙门菌沙门菌控制及其公共卫生意义【Ｊ］．中国家禽， ２０１０，（２２）：１—３． 【２ 张则斌，王芳．２］鸭沙门氏菌的分离与鉴定［Ｊ］＿中国家禽，２００７，２９ （２３）：４５—４６． ３讨论与分析 本研究对肉雏鸡感染鼠伤寒沙门氏菌的病例进行了诊断，根 据细菌形态、生化试验、ＰＣＲ鉴定、血清学分型、动物回归试验 等，鉴定得到１株鸡源鼠伤寒沙门氏菌。由于鼠伤寒沙门氏菌具有 较强的传播能力，因而需要加强对鸡肉产品的检疫，防止鼠伤寒 ［３］刘蓓蓓．沙门菌沙门菌ＰＣＲ检测方法的建立及其初步应用【Ｄ］．扬州 大学，２００９． ｆ４］中华人民共和国卫生部．食品卫生微生物检验沙门氏菌检验［ｓ］．北 京：中国标准出版社，２０１０． （上接第９页） ２．３．３加速市场开拓 ２．３．５发展社会化服务组织 鼓励农民和其他经营者以资本和劳动自愿联合组成畜牧合作 畜产品深加工滞后及流通不畅是巧家县畜牧业发展中的突出 问题。培育和开拓、完善畜产品市场体系，进一步搞活畜产品流 社，鼓励、帮助组建养殖协会，发展中介组织。鼓励专业合作社、通，成为产业化进程的关键环节。构建布局合理、结构优化、运 行业协会、中介组织等发展多种形式的产前、产中、产后的社会化 营畅通、符合畜产品交易特点的市场体系，是破解农民养殖增 服务事业。在政策、资金上扶持各种类型的中介组织和个体，探索 收增效的重要环节。一是组织力量制定市场开发策略与实施方 定单牧业模式，降低流通成本，增强抵御市场风险的能力。案。二是在乡镇集市建畜牧产地交易市场，在县城建设畜产品 ２．４实施科技兴牧 交易市场。三是积极引导、鼓励各种经济成份的经济组织参与 ２．４．１加强队伍建设 （１）建立健全和完善由县、乡、村组成的畜牧科技推广服务 畜产品流通，尤其要培养、发展农民营销队伍，让他们共同形 成开发市场的主力军。四是加强农贸结合，引导、帮助农民开 体系，稳定队伍，提高素质，充分调动和发挥现有畜牧科技人员 积极性，为科技兴牧创造良好的环境。（２）对现有专业人员有针 拓市场。 对性地进行继续教育，主要是进行产品加工、市场营销、中介服 ２．３．４建立完善“公司＋基地＋衣户”的运作模式 大力引进、培植科技含量高的养殖龙头加工企业，通过规 务、信息服务等知识的培训，适时引进畜产品加工和营销的专业 模扩张和产业升级，进一步壮大经济实力，增强对养殖生产基地 人才。（３）通过机制创新，增强服务意识，充分调动畜牧科技人 的辐射带动能力。实施品牌战略，走联合开发的路子，努力提高 员的积极性。使其在生产、经营、管理不同环节，在价格信息、 产品的附加值。重点抓好以下措施：一是抓好公司与养殖大户的 防治手段，新技术不同方面全程服务。产、销衔接；二是在每乡镇扶持建设１个畜禽集转场，由公司与畜 ２．４．２加速良种普及 加大良种引进和品种改良，完善县、乡、村三级良种繁育改 禽集转场经纪人通过合同形式加强衔接，做好散养农户畜产品收 购服务；三是加强营销环节贴息资金扶持力度；四是建立健全畜 良体系，形成以黄牛冻改和猪人工授精为重点的良种改良网络。产品市场体系和畜产品流通促销激励机制，县政府每年预算一定 ２．４．３加强疫病防治 坚持“防治并举、防重于治”的方针，强化疫病综合防治、 奖励资金，对促进外销做出突出贡献的给予奖励。五是引导公司 与养殖协会、营销大户及畜禽交易市场等的衔接，相互结成利益 疫情监测体系建设。进一步加强重大动物疫病防疫体系建设，提 共同体，密切产销关系，建立一种利益均沾、风险共担、相互依 高服务功能，确保畜牧业生产安全和人民身体健康。存的产供销一体化经营机制，把生产、加工、销售和服务等环节 ２．４．４加强技术培训 用经济形式紧密联系在一起。通过“订单牧业”、 “公司＋农户” 注意农村劳力的智力资源开发和利用，通过举办培训、电视 等形式，实现贸工牧一体化、产加销一条龙的产业化经营格局。 讲座、现场指导等多种形式，搞好畜牧饲养技术的培训。 ・４７・