检出限和定量限的测定方法

KS Lam

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分析方法验证中检出限和定量限的测定

新的USP章节<1210>“方法验证用统计学工具”，已在2016年9月药典论坛（PF）42（5）中公开征求意见。<1210> 章节是作为通则<1225>“药典方法的验证”相伴的章节提出来的，其目的是提供统计学方法，用于分析方法的验证

检出限 (LOD) 和定量限 LOQ)适用于杂质测定中的杂质限度检查项目的方法验证。

按照国际协调会议(ICH)指南 Q2B, 检出限和定量限的测定方法有三种, 一是目测法; 二是信噪比法; 三是响应值的标准偏差和校准曲线斜率如下。

回归线的残余标准偏差或回归线的y轴截距标准偏差都可以作为标准偏差。

ICH 方法的计算相对简单。但作为统计程序，不能令人满意。因此USP 修改ICH检出限和定量限的计算公式。其两个原因如下：

首先，由于σ通常是未知的，因此必须确定如何最佳地估计该参数。这是复杂的，因为σ会随分析物浓度的变化而变化。Horwitz 在 1980 年提出了喇叭形的误差曲线图，如图所示

检出限 = 3.3σ/S 定量限 = 10σ/S (σ: 标准偏差；S:斜率)

(1) (2)

两个常用估计是（1）空白响应的标准偏差和（2）从关于浓度信号回归线的偏差获得的标准偏差。这个值的选择需要是在LOD附近最能代表σ的。实验室通常会选择σ的最差值。

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在对杂质进行测定时，将面临两个问题：一是避免错误 α，即杂质不存在时误将其检出；二是避免错误 β，即确实存在有害杂质时而将其漏检。因此应该避免低估检出限值而导致夸大II型错误率（β）和缩小I型错误率 (α) 。

第二个统计关注点是如何纳入不确定性，由于浓度信号回归线的准确斜率是未知的。因为回归线是一个估计，因此检出限在分析信号空间本身就是一个估计。考虑到估计回归线中的不确定性与未来相关联的变异性, USP<1210>使用如下预测区间计算公式来纠正这两个缺点。

预测区间计算公式

S = 回归线标准误差 = 平均浓度平方 m = 斜率

n = 回归分析的观测数 = 回归线的浓度

LOD和LOQ计算

<1210>例子 浓度 X (mg/mL) 面积 (信号) 0.01 0.00331 0.02 0.00602 0.05 0.017 0.10 0.03078 0.15 0.04576 0.25 0.07592

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(3)

(4)

统计 n m S t1−α:n−2 = t0.95:4 t1−β:n−2 = t0.95:4 值 6 0.3032 0.0002 2.132 2.132 0.0967 0.0419

I. USP 方法

使用上面的数据输入USP 公式 (3)和 (4)计算:

检出限 = 0.0033 mg/mL

定量限 = 0.0076 mg/mL

II. ICH 方法

使用上面的数据输入ICH 公式 (1)和 (2)计算:

a. 用回归线的y轴截距标准偏差

检出限 = 3.3 x 0.000121/0.3032 = 0.0013 mg/mL

定量限 = 10 x 0.000121/0.3032 = 0.0040 mg/mL

* 斜率: 0.3032

*y轴截距标准偏差: 0.000121

b. 用回归线的残余标准偏差

检出限 = 3.3 x 0.000194/0.3032 = 0.0021 mg/mL

定量限 = 10 x 0.000194/0.3032 = 0.00 mg/mL

*斜率: 0.3032

*回归线的残余标准偏差: 0.000194

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0.080.070.060.050.040.030.020.01000.050.10.150.20.250.3y = 0.3032x + 0.0002R² = 1 结论 : USP方法计算出的检出限和定量限高于ICH方法。这两种方法是可以接受的。

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