一种芽孢杆菌培养基及培养方法[发明专利]

*CN102212492A*

(10)申请公布号 CN 102212492 A(43)申请公布日 2011.10.12

(12)发明专利申请

(21)申请号 201110077576.4(22)申请日 2011.03.30

(71)申请人黑龙江省轻工科学研究院

地址150001 黑龙江省哈尔滨市道里区端街

43号(72)发明人李娜 张超 赵云财(51)Int.Cl.

C12N 1/20(2006.01)C12R 1/085(2006.01)C12R 1/10(2006.01)C12R 1/11(2006.01)C12R 1/07(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 6 页

(54)发明名称

一种芽孢杆菌培养基及培养方法(57)摘要

本发明涉及一种芽孢杆菌培养基及培养方法。本发明的特征在于：以玉米酒精糟液为主要原料，适量添加K2+、Na+，制成适宜芽孢杆菌生长和发酵的培养基，及利用此培养基培养芽孢杆菌时的培养方法。液体培养基成分为：调整酒精糟夜COD含量至10000～20000mg/L，K2HPO4添加量为0～1％、NaCl添加量为0～1％，初始PH 3.5～7.0。斜面培养基需再添加琼脂1～2％。培养温度28～40℃，根据生长曲线培养时间为18～22h。液体培养时，接种量为1～5％，摇床转速120～150r/min，培养时间为18～22h。应用本发明，一方面可以有效的降低芽孢杆菌培养基的成本，另一方面为酒精糟液的综合利用开辟了新的途径，可以解决糟液排放带来的污染问题。CN 102212492 ACN 102212492 ACN 102212499 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：以玉米酒精糟液为主要原料，适量添加K2+、Na+，制成适宜芽孢杆菌生长和发酵的培养基，及利用此培养基培养芽孢杆菌时的培养方法。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：调整酒精糟夜COD含量至10000～20000mg/L。

3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：K2HPO4添加量为0～1％。

4.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：NaCl添加量为0～1％。

5.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：培养基初始PH 3.5～7.0。

6.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：培养温度28～40℃。

7.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：培养时间为18～22h。

8.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：液体培养时，接种量为1～5％。

9.根据权利要求1所述的芽孢杆菌培养基及培养方法，其特征在于：液体培养时，摇床转速120～150r/min。

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CN 102212492 ACN 102212499 A

说 明 书

一种芽孢杆菌培养基及培养方法

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(一)技术领域：

[0001] 本发明涉及一种芽孢杆菌培养基及培养方法，属于微生物工程技术领域。(二)背景技术：

[0002] 芽孢杆菌的通用培养基为CM培养基，其成分为蛋白胨、牛肉膏、NaCl，成本较高。[0003] 玉米酒精糟液是玉米为原料生产酒精时，酒精发酵醪在蒸出酒精后，排出的废液。酒精发酵只是利用了原料玉米中85～93％的淀粉，其余的物质均残留在酒糟中，因此酒糟中含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、纤维素、矿物质和微生物菌体等营养成分，且不含重金属元素和有毒物。若能将可用的物质全部资源化，则不仅能解决酒精糟液排放带来的污染问题，还能变废为宝。

[0004] 本发明就是将玉米酒精糟液作为主要原料，制成适于芽孢杆菌生长和发酵的培养基。不仅大大降低了培养基成本，而且为酒精糟液的综合利用开辟了新的途径。(三)发明内容：

[0005] 本发明目的在于提供一种芽孢杆菌培养基及培养方法。[0006] 本发明是以玉米酒精糟液为主要原料，适量添加K2+、Na+，制成适宜芽孢杆菌生长和发酵的培养基，及利用此培养基培养芽孢杆菌时的培养方法。[0007] 本发明是这样实现的：液体培养基成分为：调整酒精糟液COD含量至10000～20000mg/L，K2HPO4添加量为0～1％、NaCl添加量为0～1％，初始PH 3.5～7.0。斜面培养基需再添加琼脂1～2％。培养温度28～40℃，根据生长曲线培养时间为18～22h。液体培养时，接种量为1～5％，摇床转速120～150r/min，培养时间为18～22h。(四)具体实施方式：[0008] 实施例1：蜡状芽孢杆菌[0009] 1、用营养肉汤培养基活化菌种：取蜡状芽孢杆菌斜面一只，将其在营养肉汤培养基中活化、扩大培养24h，备用。同时记活化液中活菌数。[0010] 2、酒精糟液的制备：将酒精糟离心处理，取上清液，备用。[0011] 3、酒精糟液液体培养基的配置：将离心获得的酒精糟液稀释至COD含量至12000mg/L，添加K2HPO4 0.2％，添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.0。分装三角瓶、封口。121℃，灭菌20min。备用。[0012] 4、酒精糟液斜面的配置：将离心获得的酒精糟液稀释至COD含量至12000mg/L，添

添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.0，再加入1.5％的琼脂，加热使之加K2HPO4 0.2％，

完全溶解。分装试管，封口。121℃，灭菌20min。取出后摆成斜面，备用。[0013] 5、液体培养：将步骤1的活化液，按接种量2％接种于步骤3的液体培养基中。培养条件为：30℃，摇床转速150r/min，培养20h。培养结束后，记培养液中的活菌数。[0014] 6、活菌计数对比表

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CN 102212492 ACN 102212499 A[0015]

说 明 书

营养肉汤培养基

本发明酒精糟液培养基 6.49×1082/6页

活菌数(cfu/ml)

[0016]

6.58×1087、将步骤5培养的液体种子接于步骤4制备好的斜面培养基上。培养条件为：30℃，培养箱静止培养20h。冰箱4℃冷藏保存。[0017] 8、斜面保藏菌种的计数对比：

[0018] (1)将CM斜面培养基保藏的蜡状芽孢杆菌编号为1#，将本发明酒精糟液斜面培养基保藏的蜡状芽孢杆菌编号为2#，。分别在冰箱4℃冷藏保存的第7天、第14天、第21天、第30天进行活菌计数。

[0019] (2)计数方法为采用第三级种子计数。[0020] (3)计数用培养基：[0021] ①营养肉汤培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，NaCl 0.5％，PH 7.0。分装采用250ml三角瓶添加100ml。121℃，灭菌20min。备用。采用营养肉汤培养基活化时，二级、三级种子液均使用营养肉汤培养基。[0022] ②本发明酒精糟液培养基：将离心获得的酒精糟液，稀释至COD含量至12000mg/L，添加K2HPO4 0.2％，添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.0。分装采用250ml三角瓶添加100ml。121℃，灭菌20min。采用酒精糟液培养基活化时，二级、三级种子液均使用酒精糟液培养基。

[0023] (4)种子液的制备方法：

[0024] ①营养肉汤培养基二级种子液：用接种环取CM斜面培养基保藏的蜡状芽孢杆菌(1#)一环，接入备用的营养肉汤培养基中，30℃，摇床转速150r/min，培养20h。[0025] ②营养肉汤培养基三级种子液：将①的二级种子液，按接种量2％接种于备用的营养肉汤培养基中，30℃，摇床转速150r/min，培养20h。计活菌数。[0026] ③酒精糟液培养基二级种子液：用接种环取本发明酒精糟液斜面培养基保藏的蜡状芽孢杆菌(2#)一环，接入备用的酒精糟液培养基中，30℃，摇床转速150r/min，培养20h。[0027] ④酒精糟液培养基三级种子液：将③的二级种子液，按接种量2％接种于备用的酒精糟液培养基中，30℃，摇床转速150r/min，培养20h。计活菌数。[0028] (5)活菌计数对比：

[0029]

4

CN 102212492 ACN 102212499 A

说 明 书

3/6页

实施例2：地衣芽胞杆菌[0031] 1、用营养肉汤培养基活化菌种：取地衣芽胞杆菌斜面一只，将其在营养肉汤培养基中活化、扩大培养24h，备用。同时记活化液中活菌数。[0032] 2、酒精糟液的制备：将酒精糟离心处理，取上清液，备用。[0033] 3、酒精糟液液体培养基的配置：将离心获得的酒精糟液，稀释至COD含量至12000mg/L，添加K2HPO40.2％，添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.5。分装三角瓶、封口。121℃，灭菌20min。备用。[0034] 4、酒精糟液斜面的配置：将离心获得的酒精糟液，稀释至COD含量至12000mg/L，添加K2HPO4 0.2％，添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.5，再加入1.5％的琼脂，加热使之完全溶解。分装试管，封口。121℃，灭菌20min。取出后摆成斜面，备用。[0035] 5、液体培养：将步骤1的活化液，按接种量2％接种于步骤3的液体培养基中。培养条件为：30℃，摇床转速120r/min，培养20h。培养结束后，记培养液中的活菌数。[0036] 6、活菌计数对比表

[0030] [0037]

营养肉汤培养基

活菌数(cfu/ml)

[0038]

7.09×108 本发明酒精糟液培养基 7.10×1087、将步骤5培养的液体种子接于步骤4制备好的斜面培养基-上。培养条件为：30℃，培养箱静止培养20h。冰箱4℃冷藏保存。[0039] 8、斜面保藏菌种的计数对比：(1)将CM斜面培养基保藏的地衣芽胞杆菌编号为3#，将本发明酒精糟液斜面培养基保藏的地衣芽胞杆菌编号为4#，。分别在冰箱4℃冷藏保存的第7天、第14天、第21天、

[0040]

5

CN 102212492 ACN 102212499 A

说 明 书

4/6页

第30天进行活菌计数。

[0041] (2)计数方法为采用第三级种子计数。[0042] (3)计数用培养基：[0043] ①营养肉汤培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，NaCl 0.5％，PH 7.0。分装采用250ml三角瓶添加100ml。121℃，灭菌20min。备用。采用营养肉汤培养基活化时，二级、三级种子液均使用营养肉汤培养基。[0044] ②本发明酒精糟液培养基：将离心获得的酒精糟液，稀释至COD含量至12000mg/L，添加K2HPO4 0.2％，添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.5。分装采用250ml三角瓶添加100ml。121℃，灭菌20min。采用酒精糟液培养基活化时，二级、三级种子液均使用酒精糟液培养基。

[0045] (4)种子液的制备方法：

[0046] ①营养肉汤培养基二级种子液：用接种环取CM斜面培养基保藏的地衣芽胞杆菌(3#)一环，接入备用的营养肉汤培养基中，30℃，摇床转速120r/min，培养20h。[0047] ②营养肉汤培养基三级种子液：将①的二级种子液，按接种量2％接种于备用的营养肉汤培养基中，30℃，摇床转速120r/min，培养20h。计活菌数。[0048] ③酒精糟液培养基二级种子液：用接种环取本发明酒精糟液斜面培养基保藏的地衣芽胞杆菌(4#)一环，接入备用的酒精糟液培养基中，30℃，摇床转速120r/min，培养20h。[0049] ④酒精糟液培养基三级种子液：将③的二级种子液，按接种量2％接种于备用的酒精糟液培养基中，30℃，摇床转速120r/min，培养20h。计活菌数。[0050] (5)活菌计数对比：

[0051]

实施例3：巨大芽孢杆菌

[0053] 1、用营养肉汤培养基活化菌种：取巨大芽孢杆菌斜面一只，将其在营养肉汤培养

[0052]

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CN 102212492 ACN 102212499 A

说 明 书

5/6页

基中活化、扩大培养24h，备用。同时记活化液中活菌数。[0054] 2、酒精糟液的制备：将酒精糟离心处理，取上清液，备用。[0055] 3、酒精糟液液体培养基的配置：将离心获得的酒精糟液，稀释至COD含量至12000mg/L，添加K2HPO4 0.2％，添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.5。分装三角瓶、封口。121℃，灭菌20min。备用。[0056] 4、酒精糟液斜面的配置：将离心获得的酒精糟液，稀释至COD含量至12000mg/L，添加K2HPO40.2％，添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.5，再加入_1.5％的琼脂，加热使之完全溶解。分装试管，封口。121℃，灭菌20min。取出后摆成斜面，备用。[0057] 5、液体培养：将步骤1的活化液，按接种量2％接种于步骤3的液体培养基中。培养条件为：30℃，摇床转速150r/min，培养20h。培养结束后，记培养液中的活菌数。[0058] 6、活菌计数对比表

[0059]

营养肉汤培养基

活菌数(cfu/ml)

[0060]

6.88×108 本发明酒精糟液培养基 6.90×1087、将步骤5培养的液体种子接于步骤4制备好的斜面培养基上。培养条件为：30℃，培养箱静止培养20h。冰箱4℃冷藏保存。[0061] 8、斜面保藏菌种的计数对比：

[0062] (1)将CM斜面培养基保藏的巨大芽孢杆菌编号为5#，将本发明酒精糟液斜面培养基保藏的巨大芽孢杆菌编号为6#，。分别在冰箱4℃冷藏保存的第7天、第14天、第21天、第30天进行活菌计数。

[0063] (2)计数方法为采用第三级种子计数。[0064] (3)计数用培养基：[0065] ①营养肉汤培养基：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，NaCl 0.5％，PH 7.0。分装采用250ml三角瓶添加100ml。121℃，灭菌20min。备用。采用营养肉汤培养基活化时，二级、三级种子液均使用营养肉汤培养基。[0066] ②本发明酒精糟液培养基：将离心获得的酒精糟液，稀释至COD含量至12000mg/L，添加K2HPO4 0.2％，添加NaCl 0.2％，溶解后，调PH值为6.5。分装采用250ml三角瓶添加100ml。121℃，灭菌20min。采用酒精糟液培养基活化时，二级、三级种子液均使用酒精糟液培养基。

[0067] (4)种子液的制备方法：

[0068] ①营养肉汤培养基二级种子液：用接种环取CM斜面培养基保藏的巨大芽孢杆菌(5#)一环，接入备用的营养肉汤培养基中，30℃，摇床转速150r/min，培养20h。[0069] ②营养肉汤培养基三级种子液：将①的二级种子液，按接种量2％接种于备用的营养肉汤培养基中，30℃，摇床转速150r/min，培养20h。计活菌数。[0070] ③酒精糟液培养基二级种子液：用接种环取本发明酒精糟液斜面培养基保藏的巨大芽孢杆菌(6#)一环，接入备用的酒精糟液培养基中，30℃，摇床转速150r/min，培养20h。[0071] ④酒精糟液培养基三级种子液：将③的二级种子液，按接种量2％接种于备用的酒精糟液培养基中，30℃，摇床转速150r/min，培养20h。计活菌数。

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CN 102212492 ACN 102212499 A[0072] [0073]

说 明 书

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(5)活菌计数对比：

由此可见，芽孢杆菌在CM培养基和酒精糟液培养基上均能良好的生长。经过冰箱4℃冷藏保存后，生长效果依然无差异。说明，酒精糟液培养基与通用CM培养基相比，效果相同但价格低廉。

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