小鼠部分组织的石蜡切片制作

小鼠部分组织的石蜡切片制作

一、实验原理:利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包埋,冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中,使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状.用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其组织结构.

二、材料与用具

1．材料：小鼠肝脏、脾脏等。

2．用具:溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等.

三、实验内容与步骤

1．取材及固定

取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组织块。用先用0.85％的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次,使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之.

由动物身上切取的组织必须是新鲜的,材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr.如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。

取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1，固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70％酒精中保存.不应使组织块贴于容器壁上,应记录固定液的名称，材料的种类,动物品种及开始固定的时间.

2．冲洗

固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。

3．脱水和硬化

经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。

常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水.脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升,不能操之过急,跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形.

脱水所用的酒精浓度及过程如下:

30％—→50％—→70%-→80％—→90%—→95％—→100％(Ⅰ）—→100％（Ⅱ）

组织块在各级较低浓酒精（小于70％）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过0.5立方厘米的组织块脱水时间为6～12 hr,在高浓度酒精中（大于70%）脱水时间为3 hr左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆的缺点,故在无水酒精中脱水的时间不宜过长,一般应在15~30 min左右。在脱水

瓶中酒精的量与组织块之比约为50:1。

简化步骤如下：

70％（一夜)-—80%（1 hr）——90%（30分）——95%（30分）——100％（15分）—- 酒精+ 二甲苯（15分）——二甲苯（3分）-— 石蜡+ 二甲苯（30分）——石蜡（80分）

4．透明

透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的.经过透明剂处理的组织块用肉眼对光观察呈透明现象，所以这个过程称为透明。

常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯等，这些都是穿透力强易使组织变脆的透明剂，因此透明的时间宜短,一般在20 min即可。

透明时组织块由无水酒精中取出，先放入二甲苯和无水酒精等量混合的溶剂中1 hr左右，然后取出放入纯二甲苯中20 min即可。

5．浸渗

浸渗过程是使包埋组织用的物质深入到所有的组织间隙中，然后再通过各种方法使这种物质凝固，而将组织材料包埋其中。

石蜡切片法和火棉胶切片法都需要浸渗过程。石蜡切片法是将加热的石蜡渗到组织中

而火棉胶切片法是使火棉胶渗到组织间隙中去.

在浸渗前要先将选好的石蜡分别以容器装好放在恒温箱中，使其杂质沉淀。石蜡最好选用软蜡和硬蜡两种,软蜡熔点为45~50℃之间，硬蜡熔点为56～58℃之间,60～62℃的硬蜡很少用.冬天室温较低时多用软蜡，夏天室温较高时多用硬蜡.浸渗应在自动恒温箱中进行.

组织块在各个蜡杯中浸蜡的时间如下:

软蜡1 30min

软蜡2 30min

硬蜡1 30～60min

硬蜡2 60～120min

这一时间不是固定不变的，应视组织块的种类及大小而相应延长或缩短浸蜡时间。浸蜡的总时间一般为：0。5立方厘米的组织块时间为6~8 hr;0。2～0.3立方厘米的组织块时间为3～5 hr；0.1～0。2立方厘米的组织块时间为2～3 hr。当发现蜡杯中有灰尘或组织碎块时应使其沉淀或过滤后再使用。浸蜡不透包埋后会出现白色不透明部分，此时需要在浸蜡一次。

6．包埋

包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中，石蜡包埋法如下。

浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内,然后从第四个蜡杯中取出组织块，放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切面的摆放方向。放好组织后可以自然冷却，也可以放入冷水中直接冷却。

7．修块和切片

取已经包埋好的蜡块，将纸盒拆下,用加热的刀片或解剖刀将其分成若干块（每块组织占一块），用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去,注意不要切到组织。把有组织的蜡块修成正方形或梯形。在进行塑型时一定要注意组织块切面的方向。蜡块塑好后将其粘在小木块上。注意要粘牢。最后在木块侧面用铅笔记上组织块名称、编号。

切片时采用手摇连续切片机。使用切片机进行切片时，将蜡块固定在切片机上,调好距离和所要求的切片厚度,然后用右手摇动手柄，即可进行切片了。一般来讲生物切片的厚度在5~10微米。

对于切下的切片不要用手去取,因为体温可以使蜡片粘到手上,正确的做法是用毛笔或牙签挑取，然后放在载玻片上进行展片和粘片。

8．展片和粘片

切下的组织蜡片往往带有皱褶，所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片，即把切好的蜡片平整的粘在载玻片上。展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同,一般的56~58℃的石蜡切片℃的温水进行展片，48～52℃的石蜡切片用35℃的温水进行展片。等到蜡片充分展平后,取一清洁载玻片,载玻片上涂一薄层蛋白甘油，然后在水中捞取蜡片,捞完后将蜡片摆正，放到格盘内，置38℃温箱中烘干，然后即可进行染色.

展片和粘片比较简单容易做，但是如果处理不好则无法进行染色，即使能染上色,组织切片内部的结构也往往被破坏。

9．染色和封固

采用苏木精伊红对染法（HE)染色结果是细胞核为紫色，细胞质为粉红色；苏木精伊红染色法整个染色过程如下:

取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡10min左右，这个过程称为脱蜡。脱完蜡后的切片即可进行染色,具体染色过程和时间如下：

（1）100％酒精洗去二甲苯2~5min.

（2）95%酒精2～5min.

（3）90％酒精2～5min.

（4）80%酒精2~5min.

(5）70％酒精2～5min。

（6)50％酒精2~5min.

(7）蒸馏水洗2~5min。

（8）苏木精染液10～20min。

（9）普通水洗1min。

（10）盐酸酒精分色数秒～半 min（70％酒精100 mL＋盐酸1 mL)，分色到切片为带粉红色后立即取出.

(11）自来水冲洗数 hr。镜检切片呈清朗的蓝色，细胞核非常明显。

（12）蒸馏水洗1min。

（13）50%酒精2～5min。

(14)70％酒精2～5min。

（15）80%酒精2～5min。

（16）伊红酒精溶液对比染色2～5min（95％酒精＋0.5g伊红）。

（17)95％酒精2～5min。

（18）无水酒精Ⅰ3min。

（19)无水酒精Ⅱ3min。

（20）无水酒精加等量二甲苯2min。

（21）二甲苯数 min到透明为止.

（22）自二甲苯中取出切片，放在格板内，滴少量的树胶于组织片。

（23）取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片，然后迅速放下盖玻片,树胶即迅速扩张到四周，校正好盖玻片方向。将封好的切片放置在恒温箱中干燥。

最后,将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。

四、显微摄影

封片完全凝固后，放在显微镜下观察,选择较好的切片在尼康显微镜下进行拍摄，图像保存为jpg格式文件。

五、实验结果

在观察到的小鼠肝组织中，细胞核被染为蓝色,细胞质被染为红色