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糖皮质激素性骨质疏松大鼠弓状核β-内啡肽免疫反应神经元的变化

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维普资讯 http://www.cqvip.com 科技信息 O,U教前沿0 SCIENCE&TECHNOLOGYINFORMATION 2008年第15期 糖皮质激素性骨质疏松大鼠弓状核I3;一内啡肽免疫反应神经元的变化 张为杰 (临沂师范学院体育学院 山东 临沂276005) 【摘要】目的:观察地塞米松(DEX)致雄性大鼠骨质疏松后,其下丘脑弓状核p一内啡肽(p—endorphin,p—EP)免疫反应神经元的变化。方 法:选用4月龄健康雄性SD大鼠16只,采用随机数字表法将大鼠随机分为2组,模型组给予地塞米松磷酸钠注射液以0.1mg/100g体重,肌肉 注射,2次/周,连续8周。对照组肌肉注射等量生理盐水,8周后处死取材。通过检测大鼠胫骨上段骨组织形态计量学的变化判断骨代谢的情 况;采用免疫组织化学方法观察弓状核B—EP免疫反应神经元的变化。结果:与对照组相比,模型组大鼠骨小梁面积百分数、骨小梁宽度和骨小 梁数量明显减小(P<0.05),骨小梁分离度明显增大(P<0.01);模型组大鼠下丘脑弓状核B—EP免疫反应阳性神经元的数量明显减少(P< 0 O5)。结论:弓状核B—EP免疫反应阳性神经元数量的减少可能与糖皮质激素性骨质疏松的形成具有密切的关系。 【关键词】地塞米松;弓状核;B一内啡肽免疫反应神经元;骨质疏松 【Abstract]Objective rhe purpose of this study is to establish osteoporotic rats model that was induced by Dexamethasone to detect the changes 0f山e B—endorphin neurons of hypothalamus arcuate nucleus.Methods Healthy Sprague—Dawley rats at the age of four month were adopted in this experiment.Twelve male rats were divided the NS group and DEX group.the rats of the latter were treated with DEX by intramuscular injection 1 mg. kg,twice a week,last eight weeks Immunohistochemistry was used to observe the changes of the p—endorphin neuron of hypothalamus arcuate nucleus. Results The measurement parameters of PTM for bone histomorphometry indicate that Tb.A .Tb.Th.Tb.N reduced.while Tb.Sp significantly increased compared with NS controls.The number of arcuate nucleus cells and the B—endorphin immunoreactive neurons of hypothalamus rcuatae nucleus decreased in DEX model rats.Conclusion Through this experiment it was found that there is tl1e intimate relations between osteoporosis and the reduction of B—endorphin neuron of hypothalamus arcuate nucleus.It is showed that ARC may play an impo ̄ant role in the formation of osteoporosis. 【Key words】Dexamethasone;arcuate nucleus;B—endorphin neuron;Osteoporosis 由于临床上糖皮质激素的应用及滥用,糖皮质激素性骨质疏松症 洗5分钟 4次,DAB显色:使用DAB显色试剂盒,取lml蒸馏水,加 成为仅次于绝经后和老年性骨质疏松症而居第三位.越来越引起人们 试剂盒中A,B,C试剂各一滴,混匀加至切片,室温显色,镜下控制显色 的关注,对于这方面的研究,已有多种研究报道,但下丘脑弓状核等神 时间,约7—1O分钟,然后用蒸馏水洗涤,苏木素轻度复染,常规脱水, 经内分泌系统在该型骨质疏松形成中的作用.鲜见报道.为此我们采 透明,封片,显微镜下观察。 用地塞米松造成大鼠骨质疏松的模型来研究。 1.材料和方法 1.1材料:本实验选用普通级四月龄雄性SD大鼠16只,体质量 1.2.4主要观察指标:①大鼠胫骨上段松质骨组织形态计量参数 的变化。②下丘脑弓状核B—EP免疫反应神经元数量的改变。 / 1.2.5统计学分析:实验数据用艇 表示,用SPSS11.5统计软件进 300~370g,(购自广东医学院实验动物中心,实验动物合格证书编号: 行成组t检验,P<0.05差异有统计学意义。 粤检证字:2002A013号)。B—EP一抗,SABC免疫组化染色试剂盒, 2.结果 DAB显色试剂盒等购自武汉博士德生物工程有限公司。 2.1实验动物数量分析:实验过程发现:地塞米松组大鼠逐渐出现 1.2方法: 毛发无光泽,懒动,进食减少,明显消瘦,性腺明显松软变小等变化。对 1.2.1模型制作:选用4月龄健康雄性SD大鼠16只,先称量大鼠 照组大鼠皮毛光泽较好,活动如常,体重增加明显。 体重,将大鼠按体重依次编号,采用随机数字表法随机分为2组,每组 表1 各组大鼠实验前后体重的变化(X+-S) 8只。模型组给予地塞米松磷酸钠注射液以O.1mg/lOOg体重,采用臀 部肌肉注射,2次/周,连续8周;对照组肌肉注射等量生理盐水,用法 组别 样本量 实验前 实验后 同上。8周后处死取材 1.2.2检测指标:将实验动物称重后,用3%戊巴比妥钠以0.1ml一 0.15ml/100g体重腹腔注射麻醉。采用左心室灌注固定法取材,完整剥 离出大鼠脑组织。放入4%中性缓冲多聚甲醛固定液中,3日后取出全 脑,截取由视角叉至乳头体这一段脑组织,然后经过常规酒精梯度脱 地塞米松组 生理盐水组 :p<0.05 8 8 340 ̄25 335 ̄32 380 ̄2l} 465 ̄l8 2.2大鼠胫骨上段松质骨组织形态计量参数的变化:与对照组比 较.模型组大鼠骨小梁面积百分数、骨小梁宽度和骨小梁数量明显减 切片,厚度为4um,在显微镜下找出下丘脑弓状核和正中隆起切面,挑 选2张切片作免疫组化,在10x40高倍视野下,在弓状核区域一侧选 小,骨小梁分离度明显增大,差异有显著性意义(p<O.05)。从图 两个视野,在对侧相对称部位选两个视野,分别计数其中的B—EP免 1.1.1.2可见:模型组大鼠骨小梁稀疏断裂,而对照组骨小梁排列整 疫反应阳性神经元数量,取其平均值。取大鼠左侧胫骨,剥离干净附着 齐.数量较多。 表2实验大鼠胫骨上段松质骨组织形态计量参数的变化 的肌肉组织,置入4%多聚甲醛固定液中固定一周,制作脱钙骨,采用 胶原特殊染色进行检测.采用半自动图像数字化仪测量胫骨干骺端生 长板最下缘0.5mm至3.5mm内的次级松质骨.计算出骨小梁面积.骨 小梁数量,骨小梁宽度和骨小梁分离度。 组别 样本量 骨小粱面积 骨小梁宽度 骨小梁数量 骨小梁分离 百分数(%) (um) (个) 度(urn) 8 l6.6±l_3 38.2-+8.1 4.3-+0.7 227 8 ̄58.8桕 水,二甲苯透明后浸蜡,包埋,修整蜡块后切片,切片采用冠状面连续 地塞米松组 1.2.3SABC法免疫组化:载玻片用多聚赖氨酸处理,捞片后置于烤 箱58—6O℃1h,使切片紧密粘附,切片常规脱蜡后,滴加3%H O 于切 片上,避光,室温5—1O分钟以灭活内源性酶,蒸馏水洗3次,热修复抗 原:将切片浸入装有0.01M枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,放入高压锅内, 用电炉加热至沸腾,1分钟后断电,取出烧杯,自然冷却后用PBS洗涤 生理盐水组 8 23.9 ̄2.4 :p<O.叭 47.1±4 8 5.2 ̄0.2 l5ll4±6.9 :P<O.05, 2.3下丘脑弓状核p—EP神经元的改变:p—EP呈黄色或棕黄色的 3,1.4所示。通过计数其中阳性神经元数量 2次,滴加5%BSA封闭液.室温20分钟,甩去多余液体.不洗,滴加稀 颗粒,着色于胞浆,如图1.6-+ 释1:100稀释的一抗.空白对照组采用PBS代替一抗.置于4℃冰箱 发现,地塞米松组大鼠弓状核B—EP免疫反应阳性神经元数量为9.2,与生理盐水组阳性神经元数量19.7±4.5比较,模型组B—EP免疫 中过夜,PBS洗2分钟 3次,滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,20—37℃ 3.05)。 20分钟,PBS洗2分钟 3次,滴加试剂SABC,20—37℃20分钟,PBS 反应阳性细胞数量明显减少,差异有显著性意义(P<0.维普资讯 http://www.cqvip.com 科技信息 0科教前沿0 SCIENCE&TECHNOLOGY INFORMATION 2008年第l5期 3.讨论 [6]应荐胨海勇,徐福松.补肾滋阴法对肾上腺皮质激素型肾阴虚大鼠睾丸组织 本实验过程中发现给予大鼠肌注地塞米松后,大鼠体重虽有所增 超微结构的影响『J1.中西医结合学报,2006,4(6):620-623. 加,但与对照组比较,8周后体重有明显差异,差异有显著性意义,这 [7]Bologne jc,Legro, ̄JJ.Influence of androgens on the somatotrope axis:interest 与孟萍等的发现一致【】I。而李卫平等用氢化泼尼松造成大鼠骨质疏松 in the therapy of postandropausis osteoporosis[JJ.Rev Med Liege,2004,59(1 1): 后.大鼠的体重不升反降.明显低于实验开始时的体重 。究其原因可 659—63 f 8 1Fodor M,Delemarre—van de Waal HA.Are POMC neurons targets for sex 能是因为不同种属动物分泌不同种类的糖皮质激素,其受体与各种糖 steroids in the areuate nucleus of the rat[J1.Neuroreport,2001,12(18):3989—91. 皮质激素的亲和力也不相同,导致对糖皮质激素的反应存在差别,大 f9]Pagani F,.Netti C,Guidobono F,et a1.Effects of amylin and salmOB calcitonin 鼠出现食量减少,体重下降等变化 。 on beta—endorphin-induced growth hormone and pmlactin secretion in rat[JJ. 下丘脑是重要的神经内分泌中枢,而弓状核是下丘脑与垂体联系 Neureendocrlnology,1998,68(3):220~228 的核心部位,能够合成及分泌多种神经递质及肽类物质,中枢神经系 [1f1]Ohyama T,Sato M,Niimi M,et al Effects of short~and long-temr 统中,B—EP免疫反应神经元高度集中于下丘脑弓状核。分泌的B—EP dexamethasone treatment on growth and growth hormone(GH)~releasing hormone 参与机体重要的代谢活动。本实验发现:地塞米松肌肉注射8周后,大 fGRH)一GH-insulin—like growth factor—I axis in conscious rats[J].Endocr J,1997, 鼠骨组织形态计量学检测,发生了明显变化,说明造模成功;并且发现 44(6):827——35 模型组大鼠弓状核13一EP免疫反应阳性神经元数量明显减少。地塞米 松造成大鼠骨质疏松后,其睾丸明显松软变小,已有研究证明糖皮质 激素能够诱导大鼠睾丸问质细胞凋亡,导致雄激素分泌减少[54,糖皮 质激素可以直接作用于肾上腺,减少其合成与分泌雄激素,而雄激素 能刺激生长素(GH)的分泌171。睾酮可使雄性大鼠下丘脑弓状核前阿黑 皮素原mRNA表达及B一内啡肽分泌增加,弓状核内p~EP神经元存 在雄激素受体,雄激素可能通过直接或间接作用于受体,促进B—EP 的合成。睾酮减少,可能使弓状核内B~EP阳性细胞数量减少,雄激素 可以调节该部位激素受体的表达.由于雄激素缺乏进而无法调节受体 图1 1 NS对照组大鼠 图1 2 DEX大鼠胫 的生物合成,导致弓状核分泌的B—EP降低 。说明睾酮及其受体数量 胫骨胶原特殊染色《x40) 骨胶原特殊染色《x40) 的减少,可能是导致下丘脑弓状核B—EP阳性细胞数量减少的重要因 (▲)骨小梁排列整齐, 《▲)骨小梁稀疏、断裂 素。B—EP能够诱导大鼠GH的分泌,研究发现:GHRH神经元主要集 《T)生长板 《T)生长板 中于下丘脑弓状核区域,其神经纤维伸人正中隆起,对垂体前叶GH 的合成及分泌进行精细的调节【9】。在注射DEX的大鼠,其下丘脑合成 生长素释放激素的功能降低,垂体对生长素释放激素的反应显著降 低。生长素分泌减少,胰岛素样生长因子一1明显减少口ol。GH及胰岛素 样生长因子一1对骨的生长、代谢及骨量的维持具有重要的作用.从而 使骨的代谢发生变化,出现了骨质疏松的病理改变。说明糖皮质激素 引起骨质疏松的众多机制中,弓状核B—EP免疫反应阳性神经元数量 减少可能与骨质疏松的形成具有密切的关系,但其具体机制有待于进 一步探讨。 【参考文献】 图1.3 NS对照组大鼠 图1.4 DEX大鼠 [1]孟萍,陆邦超,张忠辉,等.胰淀素治疗糖皮质激素性骨质疏松大鼠的实验研 ARC B—EP的表达(x400) ARC B—EP的表达(x400) 究们.第三军医大学学报,2002,24(10):1214~1216. (f)神经元具有阳性颗粒表达 (f)神经元具有阳性颗粒表达。 [2]李卫平,张艳,明亮,等.糖皮质激素诱导大鼠骨质疏松模型及依扑拉芬对其 (V)第三脑室 (V)第三脑室 作用的影响咖冲国药理学通报,1999,15(5):474~476. [3]刘素彩,李恩.糖皮质激素诱导骨质疏松的细胞及分子学机制fJI.国外医学 作者简介:张为杰.男,1972年生,山东省临沫县人,汉族,广东医学院生理 内分泌学分册.2000,20(1):11-13. 学硕士研究生毕业,现5-作单位:临沂师范学院体育学院,讲师,主要从事神经 [4】SilvestriniG,MocettiP,BallantiP,et a1.Cytochemical demon stration of the 内分泌系统与骨代谢的研究。 glucocortieoid receptor in skeletal cells of the rat(J].EndocrRes.1999,25:117—128. [5】童明汉,高惠宝,胡燕琴等。糖皮质激素诱导大鼠睾丸间质细胞凋亡的研究 [责任编辑:张艳芳] 冲华男科学,2000,6(1):l1—14. (上接第35页)工艺(制备和合成)、应用领域、目前技术上存在的问题 和国内外生产现状等方面进行资料的收集和整理并将其做成课件的 【参考文献】 形式进行汇报,根据汇报的内容及现场表现给分。由于这种考核方式 [1]周济.在第二次全国普通高等学校本科教学工作会议上的讲话;大力加强教 和以往方式的不同,这激发了学生探求知识的主动性和挑战性。而且, 学工作切实提高教学质量fEB/OLl http://www.pgw.ynu.edu.cn/pjwj/upload/zjjh1.hm, 学生对这种考核选修课的方式普遍表示非常欢迎。 2005—10. . 4.结语 [2]刘敦文,沈志南.在传统专业的专业课教学中实施创新教育【J1.成都教育学院 总之。作为选修课之一,复合材料学的教学改革是一项系统的改 学报,2004,18(2):35—38. [3]甘勃.复合材料将占据新飞机“半壁江山”[EB/OL].http://www.bjkp.gov.crd 革,这类课程的教学内容需要不断的更新,教学模式也不应一成不变, bjkpze/kjqy/clkx/157769.shtml,2008-2—21. 同时需要根据学生的特点调节专业知识实际应用和实践环节的比重, [413 ̄.宪平.试论大学教学评价有效性_J1.江苏高教,2004,1:88~91_ 通过努力调动学生的学习积极性,培养学生的创新意识,增强了学生的 动手能力,才能提高教学质量,课程本身才能受到学生的欢迎。教学中, 作者简介:王海(1974一),男,在读博士,讲师,研究方向为功能材料。 教师对自身教学水平和效果的注重,对学生高度负责,希望通过不断摸 索和尝试,以学生为教学主体,让学生在兴趣中学习、在锻炼中提高,才 . [责任编辑:张艳芳] 能切实加强这类课的教学效果,使它们真正发挥出最大的作用。 

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