CLSI临床微生物实验室标准解读文档

CLSI临床微⽣物实验室标准解读CLSI2010更新

CLSI 临床微⽣物实验室标准解读第三辑2010年CLSI药敏试验的更新

中国医学科学院北京协和医学院杨启⽂王辉

美国临床与实验室标准化研究所(The Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)是⼀个国际性、跨学科、⾮营利的、致⼒于发展操作标准的教育组织。其抗菌药物敏感性试验⼩组委员会(Subcommittee on Antimicrobial Susceptibility testing)每年组织该领域专家和药⼚代表等对药敏相关⽂件M100进⾏⼀次修订。⽬前我国的临床微⽣物实验室均以CLSI⽂件作为药敏指导⽂件进⾏试验操作和报告，本⽂将CLSI M100-S20(2010年)的主要更新点总结如下：⼀、主要格式的更新：

下表显⽰了⼀些在M100-S19(2009年)中位于最后的附录在M100-S20(2010年)⽂件中新的命名、编号和位置。表1. M100-S20的格式更新

M100-S19中的名称M100-S20名称/位置

附录A(ESBLs的筛选和确证试验) 补充性表格2A-S1/表2A的最后附录G(碳氰酶烯酶的筛选和确证试验) 补充性表格2A-S2/表2A的最后附录B(⾦黄⾊葡萄球菌的筛选试验) 补充性表格2C-S3/表2C的最后附录C(凝固酶阴性葡萄球菌的筛选试验) 补充性表格2C-S4/表2C的最后附录D(肠球菌的筛选试验) 补充性表格2D-S5/表2D的最后附录E(药敏结果的确证建议) 附录A/ M100-S20的最后，术语表前附录F(药敏试验的质控菌株) 附录B/ M100-S20的最后，术语表前⼆、表1和表2介绍内容中的更新

(1) 修订了“⾮敏感”的定义：M100-S20中对“⾮敏感”的定义是由于耐药菌株缺失或稀少因⽽仅确⽴了敏感性解释标准。当药物对菌株的MIC⾼于或抑菌圈直径低于此折点时需报告为⾮敏感。⾮敏感并不意味着菌株携带某种耐药机制。有可能MIC⾼于敏感折点的菌株缺乏耐药机制并且属于野⽣菌株，只不过其出现于敏感性折点确⽴后。对于“⾮敏感”的菌株，菌株鉴定和药敏结果需被再次确认。

(2) 对“使⽤头孢噻吩的折点仅⽤于预测对其他头孢菌素的敏感性”增加注释：在M100-S20中，头孢噻吩的折点仅可⽤于预测菌株对⼝服药物，包括孢羟氨苄，头孢泊肟，头孢氨苄和氯碳头孢的敏感性。旧的数据认为头孢噻吩的结果可以预测某些其他头孢菌素的敏感性可能仍然正确，但⽬前的数据尚不能⽀持此论点。

(3) 在M100-S20的第26页增加第VII部分来描述筛选试验并总结他们的局限性以及对应的确证试验。该部分总结了肠杆菌科菌、⾦黄⾊葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌的耐药表型初筛试验和对应的确证试验。(4) 在表1和1A的警告框内，M100-S20将头霉素类药物加⼊脑脊液分离菌株中不能常规报告的抗菌药物列表中。

在M100-S19中，⼝服抗菌药物、第⼀代和第⼆代头孢菌素(除外静脉⽤头孢呋⾟)、克林霉素、⼤环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类被列为脑脊液分离菌株中不能常规报告的抗菌药物，因为这些药物不是脑脊髓感染的选择药物，在M100-S20中，头霉素类药物(如头孢西丁、头孢美唑和头孢替坦)也被纳⼊此类药物。三、肠杆菌科菌相关的更新

(1) 修订了头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松和氨曲南的折点，并在折点后增加了对应的⽤药⽅案。Ⅰ修订折点的原因

在CLSI⽂件M100-S20的第17页有⼀个关于折点如何建⽴的简短注释。本段话参考的是CLSI关于折点发展的指南

性⽂件：M23－《体外药敏试验标准和质量控制参数的发展》。简单地说，修改折点涉及微⽣物学、药理学和临床数据的系统性回顾。公认的专家，制药业赞助商和监管机构参与这⼀过程，其中包括CLSI药敏试验⼩组委员会每年两次的在公开会议讨论。若为新的药物建⽴原始折点，对照的临床试验数据是必需的。然⽽在修改折点时，虽然对照临床试验是可取的，但在处理快速变化的细菌耐药机制和“⽼”的药物时这些试验往往并不可⾏。因此，⼩组委员会必须依赖于由发表的⽂献资料、专家意见和共识所⽀持的最佳实践。流⾏病学、临床实践以及任何折点修订的监管影响必须予以考虑。

折点需要修订是由于不断变化的耐药机制和细菌菌群分布，不断进步的科学增进了⼈们对临床反应药理学因素

的认识以及“最佳治疗”被临床医⽣所接受。在临床实践中常规使⽤的许多药物折点源于25年前的临床操作，⽽这些操作以今天的监管和质量保证标准来看是不可接受的。不论在美国和欧洲，不断评估和更新折点已得到了微⽣物学家、临床医⽣和监管机构的普遍认同。例如，2007年通过的美国⾷品和药物管理法修正案(FDAAA)规定FDA更新折点，并且美国FDA已经在2009年作出回应，为⾏业印发指导⽂件，以在系统性抗菌药物产品和药敏试验设备中更新药敏试验信息标记。M100-S20修订后的折点能更好地反映抗菌药物在以⽬前推荐⽅案治疗由菌株引起的感染时的真实疗效。对产ESBL菌株的研究结果发挥了重⼤作⽤。最初CLSI推荐进⾏ESBLs筛选及确证测试，并规定对于产ESBL的菌株，将青霉素，头孢菌素和氨曲南的药敏结果由敏感改为耐药，这条规定基于以下⼏点：1) 研究观察到某些产ESBL菌株，以上药物的MIC有升⾼但仍然在敏感区间(使⽤旧的折点)；2) 有限的临床观察发现，对于产ESBL菌株引起的感染，病⼈预后较差。ESBL试验建议是处理⼀个新型耐药机制的短期解决⽅案。随后，更多的耐药机制被发现(例如，新型的ESBLs和AmpC酶)，并且越来越多的菌株被发现产多种酶导致ESBL的检测更加复杂。以上事实以及⼈们对头孢菌素类和单环β内酰胺类的PK-PD因素对治疗效果决定作⽤的认识导致折点的变更。折点修订后，ESBLs筛选和确证试验将不再是决定治疗策略所必需。当菌株产多种酶时(如当菌株同时产ESBLs和AmpC酶时将导致假阴性的结果)ESBL表型检测和确证试验的准确性将降低，⽽在当前，产多种酶的菌株已⾮常普遍。菌株的MIC与临床预后的相关性强于菌株携带的耐药机制。CLSI 认为，新的折点将为病⼈治疗提供更合理的信息并降低临床实验室⼯作的不确定度和⼯作量。Ⅱ新折点与旧折点的⽐较

对于肠杆菌科菌，头孢菌素和氨曲南的折点修订如下(作为⽐较，也列出旧的折点)：表2. M100-S20 MIC折点更新(µg/ml):

表3. M100-S20纸⽚扩散法折点更新(mm):

NA=未确定

与头孢唑啉修订后MIC折点相关的抑菌圈直径折点尚未确⽴。初步的研究并没有确⽴明确的抑菌圈直径折点，并且头孢唑啉的纸⽚扩散法试验可能需要使⽤⼀种改变含药剂量的新型纸⽚。

另外，以下药物对肠杆菌科菌的折点也被重新评估但没有被修改(这些药物的纸⽚扩散法折点也没有被修改)：表4. M100-S20 MIC折点(µg/ml)

头孢西丁折点不修改是因为当前数据⽀持现有的折点。PK-PD评估表明，推荐的药物剂量在⽬标范围内。头孢替坦的折点未改变是因为没有⾜够的数据⽀持。头霉素类不被ESBLs⽔解并且头霉素的敏感结果不会由于ESBLs的确证试验阳性⽽改为耐药。

头孢吡肟折点没有修改是基于临床试验数据和PK - PD评估。临床试验证实了对于产ESBL但头孢吡肟敏感(MIC≤8µg/ml)的菌株感染的病⼈，头孢吡肟是有疗效的。PK- PD评价结果表明，头孢吡肟⽇剂量超过3克(即每8⼩时1克或每12⼩时2克)可以使头孢吡肟的药物浓度达到评估折点时所使⽤的⽬的暴露标准。

数据回顾显⽰，没有必要修订现⾏的头孢呋⾟(注射)折点，但需注意现⾏折点只适⽤于每8⼩时1.5克或更⾼的给药剂量。对于⼀般不在美国使⽤或销售的头孢菌素，如头孢孟多，头孢尼西，头孢哌酮和拉氧头孢，其折点没有重新评估。因此，当测试这些药物对⼤肠杆菌、克雷伯菌属和奇异变形杆菌的抗菌活性时，需要进⾏ESBLs筛选和确证试验。对于ESBL确证试验阳性的菌株，这些药物的敏感结果均需报告为耐药。

注射⽤头孢噻吩不再在美国使⽤。由于与肠杆菌科相关，⼝服头孢噻吩主要⽤于尿路感染的治疗。头孢噻吩的敏感性结果可代表其他⼏种FDA批准⽤于治疗尿路感染的⼝服药物的活性，包括头孢羟氨苄，头孢泊肟，头孢氨苄和氯碳头孢。故M100-S20将头孢噻吩由检测/报告A组转⾄U组。

Ⅲ使⽤新折点的报告原则：

当使⽤经修订的折点则没有必要进⾏ESBL初筛和确证试验来报告结果以指导病⼈治疗。决定是否为感染控制或流⾏病学⽬的进⾏ESBLs确证试验应与传染病医⽣，药剂师以及感染控制委员会的医务⼈员进⾏讨论决定。新的折点应与各单位的实验室报告相关⼈员共同讨论。传染病医⽣，药剂师和其他了解抗菌药物治疗的医务⼈员应教导其他医⽣关于折点修订的情况以及如何⽤新折点指导药物使⽤。重要的是，那些使⽤药敏结果指导治疗决策的

医⽣须知道，新的折点适⽤于美国FDA批准的给药⽅案(如M100-S20表2A所列)。这些反映了来⾃制药公司处⽅信息或产品标签的成⼈标准治疗剂量。各医疗机构的药物剂量和药物调整政策需重新评估以保证与CLSI推荐折点相⼀致，因为临床医⽣不太可能要求实验室的常规报告上注明给药⽅案。Ⅳ修订后折点与ESBL的关系

不是所有的产ESBLs菌株使⽤新修订的折点均检测为耐药。修订后的头孢菌素和氨曲南折点都关注于MIC和药代动⼒学⽽不是耐药机制。正如前所⽰，某些ESBL⽔解某些头孢菌素的能⼒强于其他药物，从⽽导致某些药物(如头孢噻肟)对产酶菌株的MIC明显⾼于其他药物(如头孢他啶)。另外，不同菌株的产酶量是有差异的，因此当产酶量多时MIC会升⾼。当使⽤经修订的折点则没有必要进⾏ESBL初筛和确证试验来报告结果以指导病⼈治疗。某种耐药机制可以导

致不同强度的耐药性，如ESBL对头孢菌素和氨曲南。这些差异可以导致不同的MIC。例如，⼀些产ESBL菌株⽤修订后折点对头孢他啶敏感但对头孢曲松耐药。同样，另⼀个产ESBLs菌株可能对头孢曲松敏感⽽对头孢他啶耐药。⽬前建议，这些头孢菌素的敏感结果在报告时不改为耐药，因为研究表明，MIC是产酶菌株感染治疗预后的最佳指标。Ⅴ修订后折点与AmpC的关系

与产ESBLs菌株⼀样，并⾮所有产AmpC酶菌株⽤修订后折点将测试为耐药。这是因为除了克雷伯菌属和⼀些⼤肠杆菌外，⼤多数肠杆菌科细菌均低⽔平产染⾊体AmpCβ-内酰胺酶，头孢菌素的MIC较低并处于敏感范围(使⽤新折点)。然⽽，最常见的AmpC酶介导的耐药是因为产⾼⽔平AmpC酶突变株的选择(“去阻遏突变体”)从⽽灭活头孢菌素类继⽽导致耐药。⼀个例外是头孢吡肟，其不容易被AmpC酶灭活。在所有情况下，建议将检测结果和报告结果⼀致。如果菌株⾼产AmpC酶合并孔通道缺失，也可能对碳青霉烯类、青霉素类和头孢菌素类均耐药。⽬前CLSI不推荐任何检测肠杆菌科菌中AmpC酶的试验。⼀些AmpC酶的表型检测试验已公布但⽬前这些实验还未充分评估，因此尚未被CLSI推荐。正如ESBLs检测试验，CLSI不推荐AmpC酶检测试验以进⾏治疗决策。决定是否为感染控制或流⾏病学⽬的进⾏AmpC检测应与传染病医⽣，药剂师以及感染控制委员会的医务⼈员进⾏讨论决定。由于没有检测产AmpC酶表型的标准化⽅法，这些⽅法的局限性，必须传达给那些使⽤这些结果的⼈员。

Ⅵ修订后折点在商品化药敏系统中的应⽤

若满⾜以下条件则可在商品化药敏系统中使⽤修订后折点：1) 药敏系统的最低药物测试浓度需能容纳修订的

折点浓度; 2) 有⼀套体系可使⽤修订的折点来解释MIC结果(例如，能够修改软件系统中的折点或⼿⼯解释药敏结果)和3) 需进⾏实验室内验证。此策略也在CLSI的M100-S20第18页指出：“通过与传染病医⽣和药房部门以及治疗和药剂业及感染控制委员会的医务⼈员进⾏讨论，临床实验室可推⾏修订的折点”。对于纸⽚扩散法，⼀旦CLSI在M100⽂件中公布了其新的折点，临床实验室即可采⽤。如果药敏系统包含的抗菌药物浓度⾜以使⽤CLSI折点解释药物敏感性，那么，实验室经过适当的验证后即可使⽤CLSI折点解释和报告药敏结果。

表5. M100-S20中新增的药敏质控范围四、葡萄球菌属相关的更新

(1) 澄清对苯唑西林耐药⾦黄⾊葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌的结果报告原则：在M100-S20中，对于苯唑西林耐药⾦黄⾊葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌(MRS)，β内酰胺类药物，如青霉素类、β内酰胺/β内酰胺酶抑制

剂复合药物、头孢类(除外新型的有抗MRSA活性的头孢菌素，如ceftaroline和ceftobiprole)和碳青霉烯类体外可能敏感但临床⽆效，因此除了有抗MRSA活性的新型头孢菌素外，其他β内酰胺类药物的结果均需报告为耐药或不报告。

(2) 修改将⾦葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌寄送⾄参考实验室确认的建议：建议将万古霉素MIC≥8µg/ml的⾦黄⾊葡萄球菌和MIC≥32µg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌寄送⾄参考实验室确认。

(3) MRSA菌株的扩展定义：MRSA指表达mecA或其他甲氧西林耐药机制(如青霉素结合蛋⽩对苯唑西林亲和⼒改变，修饰的⾦葡菌，MOD-SA)的⾦黄⾊葡萄球菌。

(4) 对于对青霉素敏感但是可能产β内酰胺酶的葡萄球菌，β内酰胺酶测试试验的局限性进⾏了扩展讨论：对

于青霉素MIC≤0.12µg/ml或抑菌圈直径≥29mm的葡萄球菌需进⾏诱导性β内酰胺酶试验。然⽽，青霉素敏感的⾦葡菌很少，对青霉素敏感的菌株仍多产诱导性β内酰胺酶。因此对于严重感染，实验室应⾸先进⾏青霉素的MIC检测，⽽后再进⾏诱导性β内酰胺酶试验。

(5) 澄清了当头孢西丁和苯唑西林同时被⽤于测试⾦葡菌或路登葡萄球菌，当其中⼀个试验耐药时的报告建

议：当头孢西丁和苯唑西林同时被⽤于测试⾦葡菌或路登葡萄球菌时，只要其中⼀个耐药，即可报告“苯唑西林耐药”(6) 增加利奈唑胺纸⽚扩散法和MIC法的“耐药”解释标准：在M100-S20中，30µg利奈唑胺纸⽚的纸⽚扩散法耐药折点为≤20mm，MIC法的耐药折点则为≥8µg/ml。

(7) 进⼀步讨论耐酶青霉素类的交叉敏感性：假如检测青霉素酶稳定的青霉素类药物，苯唑西林是优先选择的

抗菌药物，其结果可以⽤于预测其他青霉素酶稳定的青霉素类药物，邻氯西林，双氯西林，氟氯西林，甲氧西林和奈夫西林。(8) 强调了对于苯唑西林MIC在0.5-2µg/ml的⾮表⽪葡萄球菌的其他凝固酶阴性葡萄球菌中进⾏附加试验的建议：苯唑西林折点可能会⾼估了⼀些凝固酶阴性葡萄球菌的耐药性，因为⼀些⾮表⽪的凝固酶阴性葡萄球菌在苯唑西林

MIC为0.5-2µg/ml时并不携带mecA基因(苯唑西林耐药折点为≥0.5µg/ml)。因此，对于苯唑西林MIC在0.5-2µg/ml 的⾮表⽪葡萄球菌的其他凝固酶阴性葡萄球菌引起的严重感染，推荐检测mecA或PBP2a或采⽤头孢西丁纸⽚扩散法。五、其他菌种相关的更新

对于铜绿假单胞菌，M100-S20删除⼀条建议:“在治疗铜绿假单胞菌感染时推荐联⽤另⼀种抗菌药物(如氟喹诺酮类药物或氨基糖苷类药物)”。对于不动杆菌属：将黏菌素和多粘菌素B从实验报告C组中删除。

对于肠球菌，修改进⾏β内酰胺酶试验的建议：由产β内酰胺酶导致的肠球菌耐青霉素和氨苄西林⾮常罕见，

因此肠球菌的β内酰胺酶不必常规检测。对于β溶⾎链球菌，修改有关青霉素和其他β内酰胺类药物的交叉敏感性的评论：对于A、B、C、G群β溶⾎链球菌，若青霉素敏感，可认为菌株对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢拉定、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟、亚胺培南、厄他培南和美罗培南敏感。另外对于A群链球菌，青霉素敏感可认为对头孢克罗、头孢地尼、头孢丙烯、头孢布坦、头孢呋⾟、头孢泊肟和头孢匹林敏感。对于草绿⾊链球菌，删除以下建议：“若菌株对青霉素敏感则可认为对其他β内酰胺类药物敏感”。并澄清表

2H-2中所涵盖的菌株：草绿⾊链球菌包括以下5个菌群，每个菌群包含⼏个菌属：可变链球菌群、唾液链球菌群、⽜链球菌群、咽峡炎链球菌群(以往的⽶勒链球菌群)和mitis链球菌群。咽峡炎链球菌群包括⼩菌落A、C、F、G群β溶⾎链球菌。对于脑膜炎奈瑟⽒菌，在头孢噻肟和头孢曲松间加“or”。六、关于药敏质控的更新

M100-S20中新增的药敏质控总结如表5：七、关于药敏试验操作的更新

(1) 在进⾏稀释法药敏试验时，操作⼈员需要了解制备抗⽣素母液所需的溶解液和稀释液，M100-S20⽂件中增加了对三种抗菌药物母液制备所需溶解液和稀释液的注释：Besifloxacin的溶解液为甲醇，稀释液为⽔；Fidaxomicin的溶解液为⼆甲基亚砜，稀释液为⽔；Razupenem的溶解液和稀释液均为pH7.2，0.01mol/L磷酸盐缓冲液。

(2) M100-S20在表5B中总结了复合药物药敏试验的母液配置原则：对于阿莫西林-克拉维酸，母液中阿莫西林和克拉维酸的浓度⽐应为2:1；对于氨苄西林-舒巴坦，母液中氨苄西林和舒巴坦的浓度⽐应为2:1；对于哌拉西林-他唑巴坦，须保证每个药物浓度中的他唑巴坦浓度均固定为为4mg/ml，哌拉西林则对倍稀释；对于替卡西林-克拉维酸，须保证每个药物浓度中的克拉维酸浓度均固定为为2mg/ml，替卡西林则对倍稀释；对于甲氧苄啶-磺胺甲唑，母液中甲氧苄啶和磺胺甲唑的浓度⽐应为1:19；对于喹奴普汀-达福普汀和Linopristin-flopristin，由于初始药粉即制备成复合形式，故进⾏药敏试验时对其单药的浓度配⽐⽆要求。

⼋、脆弱拟杆菌群的累积抗菌药物敏感性报告

M100-S20⽂件的附录C对2006年1⽉1⽇⾄2008年12⽉31⽇从美国医院分离的脆弱拟杆菌群进⾏了累积抗菌药物敏感性分析并总结成表，以指导临床经验⽤药(见表六)：

表6. 脆弱拟杆菌群的累积抗菌药物敏感性报告九、术语表的更新

M100-S20中，术语表I为ceftaroline和ceftobiprole增加新的抗⽣素亚组(有抗MRSA活性的头孢菌素组)；术语表I和II中，将besifloxacin加⼊氟喹诺酮亚组，将razupenem加⼊碳氰酶烯亚组，将ulifloxacin(prulifloxacin)加⼊氟喹诺酮亚组。参考⽂献

1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twentiethinformational supplement. CLSI documents M100-S20. CLSI, 2010

2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Nineteenthinformational supplement. CLSI documents M100-S19. CLSI, 2009.