蛋白质测定方法总结

蛋白质检测方法总结

双缩脲法：

将两分子尿素分子加热脱去一分子氨而形成的就是双缩脲

（NH2-CO-NH-CO-NH2）。双缩脲在碱性溶液中与CU2+结合形成紫红色络合物，这样的呈色反应，称之为双缩脲反应。因为蛋白质含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-),也可以在碱性条件下与CU2+进行双缩脲反应，生成紫红色的络合物。且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L这个范围内有良好的线性关系。

双缩脲法灵敏度较低1~20mg，实验时间20~30min，干扰物质有硫酸铵，TRIS，部分氨基酸。主要用于快速测定，但是不太灵敏，不同的蛋白质显色相似。Folin-酚试剂法（Lowry法）：

此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

Lowry法是较早发展的一种灵敏的检测方法，最低灵敏度为5μg，通常测定范围20～250μg。优点是灵敏度高，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差，干扰物质较多。

考马斯亮蓝法（Bradford）：

考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是19__年Bradford建立，试剂配制简单，

操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

Bradford法是灵敏度更高的一种方法，优点有：灵敏度高，比lowry法高4倍左右，最低检测达1～5μg；测定快速、简便，染色稳定；干扰物质少。缺点是用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；仍有干扰，如SDS、去污剂、Triton_100等；标准曲线有轻微的非线性。BCA法：

其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法（考马XX）相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

凯氏定氮法：

测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。操作复杂，但较准确，只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。