豚鼠心房肌细胞的分离及其电生理特性

JOURNALOFXI'ANMEDICALUNIVERSITY

Vol.23No.2

r.2002Ap

◇技术方法◇

豚鼠心房肌细胞的分离及其电生理特性

孙

强，臧伟进，于晓江，赵正航，王昌利

（西安交通大学医学院心血管生理药理研究室，西安7）10061

摘要：目的建立单个心房肌细胞的急性分离方法并记录其电生理特性。方法采用改进的此方法简

酶解分离法分离单个细胞并经膜片钳全细胞记录法进行鉴定。结果单、快捷，分离出的心房肌细胞具有正常的电生理特性。关键词：心房肌细胞；分离；膜片钳；豚鼠中图分类号：R331.3

文献标识码：B

采用本方法分离出典型的

豚鼠单个心房肌细胞并记录到豚鼠心房细胞毒蕈碱型钾电流及L型钙电流。结论-

文章编号：（）0258-0659200202-0202-02

itrialLoctesandobservationofitselectrohsioloicalIsolationofguinea-pgayypyg

roerties∥SunQiananeiin，YuXiaoiantal∥Divisionofg，ZgWjjg，epp

，M’CardiovacularPhsiolondPharmacoloedicalColleeofXianJiaotonygyagygg

，’，Xian710061China.University

：ABSTRACTObectiveToconstructamethodofisolatininleguinea-itrialmocteandtogsgpgayyjmeasureitselectrohsioloicalroerties.MethodsWeusedtheimrovedenzmaticdissociationpygpppymethodandthepatchclamhole-cellrecordin.ResultsTheticalsinleguinea-itrialpwgypgpga

+2+

（）n，moctecouldbeisolatedwiththismethodandmuscarinicKcurrentIdL-teCayyypkACha（I），currentcouldberecorded.ConclusionCaL

，，Theimrovedmethodsimleandquickcanpp

dissociateatrialmocteswithnormalelectrohsioloicalroerties.yypygpp

：；；；KEYWORDSuinea-iatrialmoctedissociateatchclamgpgyypp心肌细胞的分离方法不断得到改进，根据实验

［，］12

目的的不同，不断调整分离程序及方法。单个

1材料和方法

体重（），雌雄1.1动物健康成年豚鼠，250+50g

不拘，西安交通大学医学院实验动物中心提供。（A，美国1.2试剂和溶液的配制乙酰胆碱ch

-1

，（m・：；Sima公司）Trode’s液molL）NaCl136.9gy；；；（SKCl5.4MCl.5NaHPO.33HEPESimagg20240公司）；；；用N5.0Glucose.HO10.0CaCl.8aOH调221。无钙液：不含C的TH至7.4aClrode’s液。酶py2

-1

液：胶原酶（Y，，・，；蛋白酶akultJaan500Um2mpg）g（），；牛血清白蛋白（B，华美公司）XVSima1mSAgg

心肌细胞是应用膜片钳技术进行心肌电生理研究的基础，而酶解分离成年动物心脏做细胞标本是目前最常用的方法。但酶液对心肌组织的灌流量及消化时间不易掌握，因而要得到细胞膜完整、平滑、耐钙的适合高阻抗封接的细胞标本仍是比较困难的。而心房肌细胞直径明显小于心室肌细胞，其高阻抗封接的难度也明显大于心室肌，因而对单个心房肌细胞质量的要求更高。目前，国内此方面的工

［］3

，经过改进，成作开展较少，作者参考国外的方法

功分离出单个心房肌细胞，并运用全细胞膜片钳技和I。术记录到I，K，AchCaL

收稿日期：修回日期：2001-09-102001-12-18

基金项目：国家自然科学基金资助课题（N；o.39870334

）；教育部科学技术重点项目（0）及No.399702731161

教育部高校博士学科点基金（）20010698034

作者简介：孙强（1），男（汉族），硕士，研究方向：心血管生理971-药理.

；无钙T’。记录钾电流的电极25mrodes液40mLgy

-1

・：（S）；内液（mmolL）otassiumasartateima130KClppg

；；G（）；（）；20KHPOTASima5.0NaATPSima3gg241E2（S）；；NaGTPima0.1HEPES5.0H用KOH调至gp3［］3-1

（m・；7.3。记录钙电流的电极内液molL）CsCl

；；M；E；；100TEA-Cl20ClPES5MATP3gg23H，。未注明试剂为国EGTA10H用CsOH调至7.3p

豚鼠心房肌细胞的分离及其电生理特性

产试剂。

1.3方法1.3.1单个心房肌细胞的分离

豚鼠击昏后迅速

悬液滴入倒置显微镜（O，日本）的细胞池lmusyp（容积约0中，待细胞贴壁稳定后，室温下.35mL）’・mTrodes液灌流，2mLin。采用Axoatchyp

（A美国）和全细胞膜片钳技200B放大器xon公司，

术记录观察细胞膜电流，并用P（Aatchclam6.0x-p

-1

开胸取出心脏，置于温浴（的T’37࠷左右）rodesy液中，修剪后挂于L行主动anendorff灌流装置上，g脉逆行灌流，灌注压7O。灌流步骤：①正0cmH2

’使心脏复跳以冲去淤血，常Trodes液冲灌心脏，y约2；’~3min②无钙Trodes液灌注至心脏充分y

停跳，以解除心肌细胞间的桥粒和连接，使心肌松弛，约5m；剪下左右两in③酶液消化5min左右，个心耳，洗去酶液后在正常T’搅rodes液中剪碎、y拦、吹打，200目尼龙网过滤后即分离出单个心房肌细胞标本［上述液体均用1（体积比）氧饱00%和，并保持温度3，在T’7࠷左右］rodes液稳定30y（可放置于室温下或冰箱中）。min后备用1.3.2膜片钳技术记录钾电流及钙电流将细胞

）和RM-（第四军on6280多道生理信号记录系统

医大学）软件记录。2结

果

采用这种酶解急性分离的方法，分离出棒状、横纹清晰、细胞膜完整的单个心房肌细胞（见图），存活率6在冰箱中保存，可存活110%~70%，2

-5-1

・h以上。膜片钳全细胞记录到10mmolL（）和L-型钙ACh引导出的毒蕈碱型钾电流IK，ACh

）（见图2、图3）。电流（I，CaL

2期

毛云英，陈

玺，林淑金.绞股蓝对原发性肾病综合征患儿血清脂代谢的影响205

2.3治疗Ⅰ组与治疗Ⅱ组尿蛋白消退情况在观察血脂

变化同时，我们还观察了两组治疗前后尿蛋白消退情况，结果发现经治疗1个半月后治疗Ⅱ组不仅尿蛋白消退比治疗而且尿蛋白反复亦明显减少（见表3）。Ⅰ组更理想，

表3治疗Ⅰ组与治疗Ⅱ组治疗前后尿蛋白

的比较

组

别

-1

（・x+ s，24h）g

绞股蓝含有多种人参皂甙（如人参皂甙R，b，d，b1R3R，g等）和绞股蓝皂甙（如视为原人参二醇和原人参三F2R3醇的异构体）。该药具有降低血清T、chTG和升高具有抗动脉粥样硬化物质H另外还有调节脂肪代谢，阻DL作用，止脂质在血管壁的沉积，对抗糖皮质激素副作用，增加体液免疫和细胞免疫机能，从而对NS患儿肾小球损伤可起到一定的保护作用。绞股蓝在治疗过程中无任何副作用，且来源广泛，价格低廉，在NS患儿的治疗中值得推广。

n2020

治疗前2.53+1.452.61+1.38>0.05

治疗后0.66+0.400.27+0.22<0.05

治疗Ⅰ组治疗Ⅱ组

P值3讨

论

参考文献：

］陶建瓴，李学旺，苏颖，等.低密度脂蛋白及氧化修饰低［1

密度脂蛋白对人系膜细胞增殖及基质合成的影响［］J.中华肾脏病杂志，，（）：2000165312.［］2OdaH，KeaneWF.Liidsinporessionofrenaldiseasepg［］，，（S）：J.KidneInt199752u2S36-38.ypp6［］，，3RuanXZVarheseZFemandoR，etal.Ctokinereu-yg

lationoflowdensitioroteinrecetorenetranscritionyLpppgp

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系膜细胞分泌系膜基质的影响［J］中华儿科杂志，.，（）：199937294.

（编辑

卓选鹏）

近年来，学者研究发现NS患儿存在着脂质代谢紊乱，主要表现为高脂血症，面高脂血症对肾脏有一定的损伤作

［］2~5

用。本文观察结果，40例NS患儿存在明显的脂质代

谢异常，主要表现为高胆固醇血症，以及LDL和VLDL明显升高，与文献报道一致。NHDL部分降低，S患儿高血脂症的原因是多方面的，目前的观点是NS患儿白蛋白及大分子物质从尿中丢失，低蛋白血症刺激肝脏合成过多脂蛋白A（载脂蛋白）引起L同时肝脏合成胆固醇POBDL增加；也增加，与过多LDL受体活性降低，LDL从血中清除缓慢，

［］6

脂蛋白结合，肝脏产生过多V，继而引起高脂血症。LDL有学者研究提示：高脂血症通过系膜损伤发展为肾小球硬化，造成免疫和非免疫介导肾脏疾病的持续和发展，也是诱发和加剧肾小球硬化的主要因素。近年来国内外学者对LDL与肾小球硬化的关系研究成为肾脏病学领域中的热

［］7

点之一。而降脂治疗确能改善肾组织损伤，减轻尿蛋白的排泄。本文观察治疗Ⅱ组加用绞股蓝治疗1个半月发现且尿高脂血症及低蛋白血症的恢复均明显比治疗Ⅰ组快，蛋白的清退亦比治疗Ⅰ组理想，说明较股蓝不仅可有效的调节N而且又有利于消除尿蛋白，从S患儿脂质代谢异常，而对肾脏起到一定的保护作用，提高了NS患儿缓解率。因此药物降脂治疗对NS患儿很有必要。

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，，：（上接第2Res199428280-286.03页）有较大影响，因而实验中配方一旦确定下来，不宜轻

［］4

易改动。实验中细胞的贮存国外多采用KB液

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［］陈吉球.心肌细胞分离术［］中国病理生理杂志，，4J.1999

（）：155475-477.

（编辑

韩维栋）

（一种高钾低氯溶液），但复钙后多会引起细胞体积收缩，而心房肌细胞本身较细，所以其收缩后不易封接。我们的实验中采用胶原酶和蛋白酶混合的方

-1

法，并直接复钙至1・分离出单个.8mmolL的方法，

心房肌细胞，并记录到其正常的I和I，证明，，KAChCaL本方法是一种简单、快捷的酶解分离方法。参考文献：

［］［］1JanT.HowtoisolatecardiacmoctesJ.Cardiovascyy