卷第第!以刀 年!期月发酵科技通讯∀一谷氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究陈宁张克旭天津的#天津轻工业学院食品工程系王东洋李建河#山东菱花集团公司济宁!∃!%&摘(−./要∋采用黄色短杆菌#+,∗)∗)0,2 12利用紫外线硫酸二乙醋进行诱变定向选育出具有寡霉素抗性谷氨酸氧肪酸盐抗性的温度敏感突变株<5%!3&4为始发菌株根据代谢控制发酵原理%6然后以温度敏感突变株%6和产酸率高#%以上&的天津短杆4:;6为亲株通过原生质体融合技术成功地选育出了产酸率高的融合子并且该菌株系温度敏感型菌株可用于谷氨酸强制发酵?在6扩发酵罐上进行中试产酸达在摇瓶条件下产酸达6岁=>,6梦=,转化率达6!9关键词∋温度敏感突变株育种发酵以上菌种均为天津轻工业学院代谢控制发酵引言;8∃年木下朝井等人创立微生物发酵法自研究室保存菌种!!方法生产氨基酸以来迄今已有四十多年的历史经!!ΕΦΓ诱变进行诱变测定不同诱变时间过各国科学家的不懈努力在全世界已建立了完整的氨基酸工业体系采用9ΕΓΦ对于利用微生物进行工业的杀菌率绘制致死率曲线具体诱变过程如图发酵来说完全可以在不改变现有发酵设备的条所示件下通过改进生产菌株来大幅度的提高氨基酸的产量和质量∗杆菌#()+!!!紫外线诱变因此优良生产菌种的选育一直%采用巧Η紫外灯照射距离/照射时间的杀菌率绘制致死率曲线新鲜活化斜面≅测定不同是氨基酸发酵的主要研究课题,−.∗0∗),本文采用黄色短≅1 Α代谢控制发酵原理利用紫外线硫酸二乙酷进行诱变定向选育出具有寡霉素抗性谷氨酸氧肪酸盐抗性的温度敏感型突变株度敏感型突变株的天津短杆菌4:;6≅1+.&4Β为出发菌株根据,!℃专,6肉汤·次俪培养。%6然后以温65%4和产酸率高#)Χ以上&取“菌液离。弃去上清液Ι为亲株通过原生质体融合 !Ι技术<Δ菌体。磷酸缓成功地选育出了产酸率高的融合子!%并且该菌株系温度敏感型菌株可用于匀悬浮后取#间∀磷酸缓冲液均令%&∃∋(带玻璃珠三角瓶…冲液洗涤“次谷氨酸强制发酵在最佳条件下谷氨酸产酸率9以上达69糖酸转化率达6%)装有材料与方法材料&磷酸缓冲液,蒯。ΑΒ=原液、今∗ !Χ∃℃恒温振荡诱变Ε次%&ΧΧΔ771∋加人4终止反应摇匀菌种2黄色短杆菌)−.013//天津短杆菌)−.0/.511:3/5/6∋71.;6∋51<∋387,91∋/=/,9>?≅∗图∗稀释涂平板ΑΒΦ诱变步骤发酵科技通讯第卷#&&∋菌体培养<∋Α!Κ值测定()∗+,−取新鲜菌斜面,环于∋.耐液体培养采用:4,)分光光度计培养液种子液发酵基13中∋&℃/0而振荡培养&2取.4以该菌液稀释4.倍测其!Κ+印Λ0液于∋.5(56液体培养基中&∋℃/0173振荡培养<2ΑΦΓ值测定&34加人终浓度.2洲而的青霉素)继续培养采用精密ΦΓ试纸<ΦΓ+2一ΒΑ.测定至所需要的时间8(,.+−取新鲜菌斜面,环于∋.而液体培养∋结果与讨论基中∋&℃/10而振荡培养&23取.4耐该菌∋,!ΔΗ诱变条件的选择于∋.血液体培养基中犯℃/1096振荡培养一定剂量的ΚΔΗ对细菌有致死性目前倾&34加人终浓度.:川血的青霉素)继续培养向于认为较低的杀菌率下正向突变率更高一至所需要的时间般采用杀菌率:./一.Β/甚至更低本实验采&&2原生质体的形成用终浓度为,/<Μ1ΑΜ的ΚΔΗ进行处理诱变时取上述菌体培养液各4而于不同离心管中间与致死率的关系如图&所示2以;〕10而离心,.而去上清液用高渗液洗&曰!甘 2次悬于高渗液中加人蛋清溶菌酶<()∗+,为59=13558(>肠为?≅9岁而Α于2∋一+∋℃保温<随时镜检乙∃观察原生质形成发现情况Α然后匕八 谈份絮2仪幻01而离心,.而去上清液用高渗液洗&八以次悬于高渗液中备用&&4原生质体的融合将新本原生质体各&4而混合2以;Α01而离.,.&.∋.,.4.+.心.,而去上清液加入2Β血的4∋/ΧΔΕ一口以;Α#,Ν溶液并加人.&耐的新生磷酸钙溶6−、液混合均诱变时间<Α匀于∋2℃保ΔΚΗ对黄色短杆菌,(的致死率曲线温∋.73图&离心去上清加人4耐高渗液混匀用高渗液适当稀释取.,时培养于由图&可知选择诱变时间为∋.73比较合高渗培养基平板上<夹层法Α∋&℃培养&一∋天适此时致死率为,Β/有利于获得更高的正向&&+谷氨酸发酵<初筛Α突变率,环经活化的菌株于&.56初筛发酵培养∋取&ΟΜ诱变条件的选择基中∋.℃/10而振荡培养23Β发酵终了测其测定了紫外线作用对黄色短杆菌的致死率产酸情况其致死率曲线如图∋所示&&:谷氨酸发酵<复筛Α由图∋可知选择紫外线诱变时间为244比取,环经活化的菌株于∋.耐种子培养基中较合适.∋℃/10而振荡培养,3.然后以.,/的接种量接于摇瓶发酵培养基中<4.时三角瓶装&.时%∃以溉井班发酵培养基Α在变速调温下视ΦΓ变化情况而及时流加尿素发酵培养2.3测其产酸情况&&Β谷氨酸发酵的检测<5Α谷氨酸测定厂采用ΗΙϑ一.2ϑ多功能谷氨酸一葡萄糖分析叮紫外线仪测定照身夕时间<Α≅<&Α葡萄糖测定图∋紫外线的致死率曲线采用ΗΙϑ一.2ϑ多功能谷氨酸一葡萄糖分析根据代谢控制发酵原理经紫外线硫酸二乙仪测定醋进行诱变定向选育出具有寡霉素抗性谷氨酸一,&一第期陈宁张克旭王东洋等%6∋∀一谷氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究,。了氧肪酸盐抗性的温度敏感型突变株变谱系如图其诱触合率所示诱变谱系 黄色短杆菌42ΦΓ诱变4∀一ΚΛ谷氨酸产量#&∀%ΙΜ多次ΕΦΜ诱变杏。1Ο以4ΜΝ: 1、多次诱变坦二一%4Ν1< ΠΟΙΝΘ≅,。图88图温度敏感突变株45%6的诱变谱系<Δ,%!,的谷氨酸发酵原生质体的形成与再生进行谷氨酸发酵定时将目的融合子<5%!一8%%%二二二二竺竺咒飞8%,Λ &!%%<.离子浓度与融合率的关系天津短杆菌4:;6及黄色短杆菌45%6均取样测定发酵液的吸光度残糖和量绘制出目的融合子∀一谷氨酸产对蛋清溶菌酶不敏感破壁前必须用青霉素进行预处理才能提高蛋清溶菌酶的敏感性%Δ!<的谷氨酸发酵过程经测定为宜曲线结果如图6所示印Β2.&?Ρ兀9以采用%?阿耐青霉素处理!Ρ 汽.,2ΟΒ肠以采用%∃7Λ耐青霉素处理4:;68一Ρ为宜!经测定天津短杆菌原生质备的∃ %、+今喇盗∃山汇%、口 劝球翔最佳条件为∋ ≅岁2 的溶菌酶在,?℃酶解Ρ∃;9在该条件下原生质体形成率达;体再生率达!原生质9经测定黄色短杆菌最佳条件为∋%Μ,2Λ时的溶菌酶在犯℃酶解巧ΡΚ5Β肠4原生质备的!蕊二在该条件下原生质体形成率达;;9原生质体再生率达!9图+原生质体的融合目的融合子Ε8.&大量实验结果表明通过改变以明显改变融合率<扩浓度可行生产试验在+时中试台上进行中试采用大种量高风量低糖流加<流加+./以上浓缩糖Α工拼一Ω春架洲一一一≅Τ‘,+曰.2Β,&&.一&2ΥΤ一‘..&Β∋&∋+2.发酉亨时间‘3Α菌株Ες,.&,,发酵过程曲线在山东菱花集团公司进<扩十浓度与原生质体融合率4:;6的关系曲线如图8所示45%6艺其与黄色短杆菌∋Ω一2谷氨酸产量,+/糖酸转化率达经测定天津短杆菌的+&Β/具有重要的应用价值原生质体融合的最佳条件为ΣΦ:6Β刃当<扩离子浓度为8%ΥΟ2?℃融合%而融合时的%为Π38Τ∀时在在该条件下原生质体融合频率可达!ς%8
