从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种[发明专利]

*CN103373901A*

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103373901 A(43)申请公布日 2013.10.30

(12)发明专利申请

(21)申请号 2013102831.5(22)申请日 2013.07.05(83)生物保藏信息

CGMCC NO.7323 2013.03.19

(71)申请人上海交通大学

地址200240 上海市闵行区东川路800号申请人山东三元生物科技股份有限公司(72)发明人程海荣 吕霁烊 王犇 邓子新(74)专利代理机构上海汉声知识产权代理有限

公司 31236

代理人牛山 陈少凌(51)Int.Cl.

C07C 31/24(2006.01)C07C 29/88(2006.01)

权利要求书2页 说明书9页 附图5页权利要求书2页 说明书9页 附图5页

()发明名称

从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种(57)摘要

本发明公开了一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种。该方法为：在赤藓糖醇母液中加入酵母菌种，进行发酵净化；所述酵母菌种为能分解代谢所述赤藓糖醇母液中除赤藓糖醇外的多元醇以及糖类的酵母菌种。所述专用酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC NO.7323。本发明采用生物发酵净化的方法从赤藓糖醇母液中工业化提取赤藓糖醇，提取效率高，对环境友好，有效地利用了废弃的资源。CN 103373901 ACN 103373901 A

权 利 要 求 书

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1.一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述方法为：在赤藓糖醇母液中加入酵母菌种，进行发酵净化；所述酵母菌种为能分解代谢所述赤藓糖醇母液中除赤藓糖醇外的多元醇以及糖类的酵母菌种。

2.如权利要求1所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC NO.7323。

3.如权利要求1或2所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A、将赤藓糖醇母液稀释2～10倍，每100毫升所述稀释后的赤藓糖醇母液中加入氮源0.2g～3g，调节pH为3.5～7.0，高温灭菌，冷却后接入酵母菌种，在25～35℃，转速为100～500转/小时的条件下进行发酵净化；

B、发酵净化结束后经过滤、脱色、浓缩、结晶、精制，即得赤藓糖醇结晶体。4.如权利要求3所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤A中，所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合。

5.如权利要求3所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤B中，所述过滤具体为：发酵净化结束后通过离心或者膜过滤的方法将酵母菌种与发酵液分离，并通过纳滤分离去除所述发酵液中的分子量大于1000道尔顿的大分子粘性物质，得澄清透明的发酵液。

6.如权利要求5所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤B中，所述脱色具体为：每100毫升所述澄清透明的发酵液中加入活性炭1～5g，在60℃～85℃下脱色，得脱色后过滤除去活性炭得到的无色或浅色的发酵液。

7.如权利要求6所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，步骤B中，所述浓缩具体为：将无色或浅色的发酵液在70℃以上浓缩到固形物含量为50～80％，得富含赤藓糖醇的糖浆。

8.如权利要求7所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述结晶具体为：将所述富含赤藓糖醇的糖浆以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆中加入0.1～2g赤藓糖醇晶体诱导成晶，离心分离，即得赤藓糖醇粗晶体与赤藓糖醇二次母液。

9.如权利要求8所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，所述精制具体为：用去离子水溶解所述赤藓糖醇粗晶体得赤藓糖醇粗晶体溶液，每100毫升所述赤藓糖醇粗晶体溶液中加入0.1～5g活性炭，在60℃～85℃下搅拌脱色30～180min；过滤分离活性炭得赤藓糖醇糖液，将所述赤藓糖醇糖液浓缩到固形物含量为20～30％后，依次进行阴离子树脂与阳离子树脂离子交换，待电导率降到100μs以下后继续浓缩到固形物含量为50～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆中加入0.1～2g赤藓糖醇晶体诱导成晶，离心分离，得赤藓糖醇精制晶体与赤藓糖醇三次母液。

10.如权利要求9所述的从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，其特征在于，还包括如下步骤：

a、将所述赤藓糖醇二次母液和所述赤藓糖醇三次母液的合并液浓缩到固形物含量为

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权 利 要 求 书

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50～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆加入0.1～2g赤藓糖醇晶体诱导成晶，得到赤藓糖醇粗晶体；

b、将所述赤藓糖醇粗晶体按照所述精制的方法进行精制，得赤藓糖醇精制晶体。

11.一种用于如权利要求1所述从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法的酵母菌种，其特征在于，所述酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC NO.7323。

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说 明 书

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从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法

及其专用酵母菌种。

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背景技术

赤藓糖醇是一种低热量具有甜味的功能糖醇，在食品领域得到较为广泛的应用。

赤藓糖醇主要是采用酵母发酵葡萄糖合成。不同的酵母在发酵葡萄糖合成赤藓糖醇的过程中，除了得到赤藓糖醇这一目的产物外，还会产生其它不同种类的多元醇。比如我国赤藓糖醇企业广泛使用的解脂假丝酵母(现在称为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica)除了合成赤藓糖醇外，还产生一定量的甘油、核糖醇、阿拉伯糖醇以及甘露醇副产物(Tokuoka K，Ishitani T，Chung WC.1992.J Gen Appl Microbiol 38：35)。木兰假丝酵母除了合成赤藓糖醇外还产生甘油副产物(Lee KH，Seo JH，Ryu YW.2002.JBiotechnol Bioeng 17：509)。发酵结束后发酵液中除了含有赤藓糖醇，还含有核糖醇、甘油、阿拉伯糖醇以及甘露醇副产物。我国赤藓糖醇工业菌株发酵液中赤藓糖醇的含量一般在140～180克/升，而副产物的含量达到10～50克/升。

[0003] 发酵液经过浓缩将赤藓糖醇多次结晶后得到的粘稠液体即为赤藓糖醇母液，该母液中副产物(除赤藓糖醇外的其它多元醇)的含量一般达到100～300克/升，赤藓糖醇的含量一般在150～200克/升，赤藓糖醇的纯度低于50％，无法再结晶。该母液除了含有赤藓糖醇、甘油、核糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇等多元醇外，还含有大分子色素、多糖、低聚糖以及发酵时加入的消泡剂等物质。这些大分子物质的存在使得通过物理的分离方法(色谱分离)难以将其中的赤藓糖醇有效的分离。虽然有从赤藓糖醇母液再提取赤藓糖醇的专利文献报道，比如，申请号为CN2012103267.X的中国发明专利公开了一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，该方法通过母液的静置沉淀以除去部分颗粒杂质，然后浓缩加入有机溶剂乙醇并在低温-5℃的条件下结晶。该方法要求加入易燃易爆的乙醇以及在-5℃的结晶条件，在大规模生产时难以做到。而且采用该方法赤藓糖醇的纯度并没有得到提高，副产物仍然存在于母液中，赤藓糖醇的结晶收率仍然很低。申请号为CN201210363274.8的中国发明专利公开了一种赤藓糖醇母液的处理方法。该方法采用在母液中加入赤藓糖醇粗晶体以提高母液中赤藓糖醇的含量，然后再精制、浓缩并结晶。但该方法需要先加入大量的赤藓糖醇粗晶体(加入2倍母液体积的赤藓糖醇含量为25-40％的赤藓糖醇粗晶体溶液)，并不经济。然后直接通过活性炭脱色与离子交换。由于母液中含有大量的胶体类粘度大的物质，活性炭脱色以及离子交换效果并不好。申请号为CN2012100422.4与CN2012104804.4的中国发明专利均描述了从赤藓糖醇母液中回收或分离提纯赤藓糖醇

二者的方法基本一致，包括用水将母液稀释，然后分别经过超滤、纳滤、浓缩结晶等的方法，

步骤。虽然经过这些处理步骤，但母液中的其它多元醇杂质并没有得到去除或分离，赤藓糖醇的含量并没有提高，因此赤藓糖醇的回收得率依然很低，没有经济上的使用价值。因此，我国赤藓糖醇生产企业大多将赤藓糖醇母液作为废弃液进行污水处理或直接排放，即浪费

[0002]

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说 明 书

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了资源又损害了环境。因此，开发一种高效的从赤藓糖醇母液中回收赤藓糖醇的方法具有重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服上述现有的赤藓糖醇母液分离技术存在的不足，提供一种从赤藓糖醇母液中高效提取赤藓糖醇的方法及其专用酵母菌种。本发明通过采用生物净化的方法，利用分离并改进的酵母将赤藓糖醇母液中赤藓糖醇以外的其它多元醇以及大分子物质分解代谢，显著提高赤藓糖醇母液中赤藓糖醇的纯度，再通过精制的过程(超滤、纳滤、浓缩、结晶以及重结晶等)，从赤藓糖醇母液中高效的分离出符合国家标准的赤藓糖醇晶体。

[0005] 本发明所使用的一种酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)，该菌株已于2013年3月19日递交CGMCC中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.7323。

[0006] 本发明所使用的酵母菌株的分离方法与特性如下：[0007] 酵母菌株CGMCC No.7323在液体培养基中(成分：葡萄糖、酵母粉以及蛋白胨各10克/升)培养24小时后单个细胞在400倍显微镜下为长椭圆形，长10-30微米，宽3-5微米，两端出芽生殖，单个细胞或者3～8个大小不同的细胞连在一串形成假丝状。菌落圆形，边缘锯齿状，表面有折皱，淡黄色或米黄色，表面干燥凸起。能在含有葡萄糖，半乳糖、木糖，木糖醇，山梨醇，甘露醇，D-半乳糖醇，L-阿拉伯糖醇，D-阿拉伯糖醇，核糖醇，甘油，麦芽糖以及低聚麦芽糖作为唯一碳源的基本培养基上良好生长，基本培养基成分为：酵母氮碱10克/升，购自BD公司，货号239210。该酵母不能在含赤藓糖醇的基本培养基上生长。将该酵母菌株在高浓度的赤藓糖醇母液的液体培养基中连续驯化50次，每次培养时间为5天，使其适应赤藓糖醇母液，提高在赤藓糖醇母液的抗逆性。通过26SrDNA的分子鉴定，该酵母菌株为假丝酵母(Candida sp.)。

[0008] 本发明是通过以下技术方案来实现的：[0009] 第一方面，本发明涉及一种从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法，在赤藓糖醇母液中加入酵母菌种，进行发酵净化即可；所述酵母菌种为能分解代谢所述赤藓糖醇母液中除赤藓糖醇外的多元醇以及糖类的酵母菌种。[0010] 优选地，所述酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC N0.7323。[0011] 优选地，所述方法包括如下步骤：[0012] A、将赤藓糖醇母液用水稀释2～10倍，每100毫升所述稀释后的赤藓糖醇母液中加入氮源0.2g～3g，该氮源可以是单一氮源，也可以是复合氮源；调节pH为3.5～7.0，高温灭菌，冷却后接入酵母菌种，在25～35℃，转速为100～500转/小时的条件下进行发酵净化；定时取样进行高效液相色谱分析，当除了赤藓糖醇以外的其它杂质多元醇分解完全时停止发酵。所述酵母菌种能分解代谢所述赤藓糖醇母液中除赤藓糖醇外的多元醇以及糖类；

[0013] B、发酵净化结束后经过过滤、脱色、浓缩、结晶，即得赤藓糖醇粗晶体；得到的粗晶体重新溶解，再经过脱色与离子交换脱盐，浓缩，再结晶，得到赤藓糖醇精制晶体。

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说 明 书

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所述赤藓糖醇母液是指，合成赤藓糖醇的酵母发酵葡萄糖合成赤藓糖醇的发酵液

经过多次结晶赤藓糖醇后，不能再将赤藓糖醇结晶出来的颜色深、粘稠、固形物含量(术语，指的是100毫升液体中含固形物的克数，即质量/体积百分比)在30％～60％的液体。该液体除了含有赤藓糖醇外，还含有其它的多元醇以及其它大分子的物质，这些多元醇包括甘油、核糖醇、甘露醇、阿拉伯糖醇，大分子物质包括麦芽糖、低聚麦芽糖、色素等。所述赤藓糖醇母液中赤藓糖醇的含量在10～30％(质量/体积百分比)。经过酵母发酵净化后，该赤藓糖醇母液发酵液中赤藓糖醇的含量占总固形物含量的70％以上。[0015] 优选地，步骤A中，所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合。[0016] 优选地，步骤B中，所述过滤具体为：采用酵母菌种即假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC N0.7323发酵净化结束后通过离心或者陶瓷膜过滤的方法将酵母细胞与发酵液分离，再通过纳滤膜分离去除所述发酵液中的分子量大于1000道尔顿的大分子粘性物质，得清澈透明的发酵液。[0017] 优选地，所述脱色具体为：每100毫升所述清澈透明的发酵液中加入活性炭1～5g，在60℃～85℃下以每分钟50～200转速下搅拌脱色，得无色或浅色的发酵液。[0018] 优选地，所述浓缩具体为：将所述无色或浅色的发酵液在蒸发器中70℃以上浓缩到固形物含量为50～80％，得富含赤藓糖醇的糖浆。[0019] 优选地，所述结晶具体为：将所述富含赤藓糖醇的糖浆以2～5℃/h的速率冷却至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆中加入0.1～2g赤藓糖醇以更好地形成晶体，离心分离，即得赤藓糖醇粗晶体与赤藓糖醇二次母液。[0020] 优选地，所述精制具体为：用去离子水溶解所述赤藓糖醇粗晶体得赤藓糖醇溶液，每100毫升所述赤藓糖醇溶液中加入0.1～5g活性炭，在60℃～85℃下搅拌脱色30～180分钟；过滤分离活性炭得赤藓糖醇糖液，将所述赤藓糖醇糖液浓缩到固形物含量为20～30％后，依次进行阴离子树脂与阳离子树脂离子交换，待电导率降到100μs以下后继续浓缩到固形物含量为50～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆中加入0.1～2g赤藓糖醇晶体诱导成晶，离心分离，得赤藓糖醇精制晶体与赤藓糖醇三次母液。[0021] 优选地，还包括如下步骤：[0022] a、将所述赤藓糖醇二次母液和所述赤藓糖醇三次母液的合并液浓缩到固形物含量为50～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温至10℃以下，在起晶点温度下每100毫升所述糖浆加入0.1～2g赤藓糖醇晶体诱导成晶，得到赤藓糖醇粗晶体；

b、将所述赤藓糖醇粗晶体按照所述精制的方法进行精制，得赤藓糖醇精制晶体。

[0024] 第二方面，本发明涉及一种用于前述从赤藓糖醇母液中提取赤藓糖醇的方法的专用酵母菌种，所述专用酵母菌种为假丝酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC NO.7323。[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：[0026] 1、发酵净化时间短，20小时以内即可将赤藓糖醇母液中除了赤藓糖醇以外的其它多元醇分解完全，转变为细胞生物量以及二氧化碳；净化结束后能高效地将赤藓糖醇提取出来，提取效率达到70％以上。

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说 明 书

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2、整个过程所采用的设备完全与赤藓糖醇发酵过程采用的设备通用，无需增加设

备；除了起始发酵培养基需要灭菌外，在发酵的过程中的补料阶段无需灭菌，操作过程更加简便。

[0028] 3、本发明采用生物发酵净化的方法从赤藓糖醇母液中工业化提取赤藓糖醇，提取效率高，对环境友好，有效的利用了废弃的资源，提取的赤藓糖醇符合我国赤藓糖醇的国家标准。

附图说明

[0029] 通过阅读参照以下附图对非性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

[0030] 图1为酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在含不同多元醇以及麦芽糖的基本培养基上的生长情况，其中A为含甘油的基本培养基，B为含甘露醇的基本培养基，C为含麦芽糖的基本培养基，D为含核糖醇的基本培养基，E为含阿拉伯糖醇的基本培养基，F为含赤藓醇的基本培养基；其中标有箭头的为酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323；

[0031] 图2为酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在固体培养基上的菌落形态；

[0032] 图3为酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在显微镜下的细胞形态(放大0倍)；

[0033] 图4为赤藓糖醇母液的高效液相分析图谱与成份分析鉴定示意图；其中A为高效液相分析图谱，B为峰(13.7min)的成份分析鉴定示意图，C为峰(18.8min)的成份分析鉴定示意图；其中，1为赤藓糖醇母液，2为13.7min峰，3为赤藓糖醇，4为核糖醇，5为甘油，6为阿拉伯糖醇，7为18.8min峰，8为甘露醇；

[0034] 图5为酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在250ml摇瓶中发酵净化赤藓糖醇母液不同时间的高效液相分析图谱；其中A为发酵净化0小时，B为发酵净化15小时，C为发酵净化20小时；

[0035] 图6为酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在1000ml摇瓶中发酵净化赤藓糖醇母液不同时间的高效液相分析图谱；其中A为发酵净化0小时，B为发酵净化15小时，C为发酵净化20小时；

[0036] 图7为酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在发酵罐中发酵净化赤藓糖醇母液20小时后的高效液相分析图谱；其中A在150升发酵罐中的色谱分析图，B为在30,000升发酵罐中的色谱分析图；[0037] 其中，图4～7中横坐标单位为时间(分钟min)，纵坐标的电压(毫伏mV)。具体实施方式

[0038] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

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说 明 书

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以下实施例中，所述的赤藓糖醇母液是生产过程中赤藓糖醇发酵液经过浓缩将赤

藓糖醇多次结晶后得到的粘稠液体，该母液中副产物(除赤藓糖醇外的其它多元醇)的含量一般达到100～300克/升，赤藓糖醇的含量一般在150～200克/升，赤藓糖醇的纯度低于50％，无法再结晶。该母液除了含有赤藓糖醇、甘油、核糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇等多元醇外，还含有大分子色素、多糖、低聚糖以及发酵时加入的消泡剂等物质。这些大分子物质的存在使得通过物理的分离方法(色谱分离)难以将其中的赤藓糖醇有效地分离。[0040] 实施例1、酵母菌种(Candida sp.)的分离与驯化[0041] 将实验室保存的350种酵母分别划线接种在分别含甘油、甘露醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、赤藓糖醇以及麦芽糖的基本培养基上(基本培养基成分：酵母氮碱0.67克/升、琼脂2克/升)，在30℃培养5天，观察各种菌株在上述培养基的生长情况。[0042] 发现有一种菌株在含甘油、甘露醇、阿拉伯糖醇、核糖醇以及麦芽糖的基本培养基上均能良好的生长，但不能在含赤藓糖醇的基本培养基上生长。

[0043] 对该酵母菌株进行26S rDNA基因的分子鉴定。扩增酵母26S rDNA基因的通用引物在相关公开数据库(比如NCBI数据库)中均能获得，提取酵母DNA的方法也能通过公开的数据库(比如Springer以及elsevier数据库)获得。扩增该酵母26S rDNA基因片段的条件为：起始变性温度95℃10分钟，扩增时变性温度95℃45秒，退火温度55℃，延伸温度72℃60秒，扩增35个循环，扩增结束后再在72℃延伸10分钟。扩增得到的基因进行测序获得DNA碱基序列，并与相关数据库(比如GenBank数据库)进行比较，发现该酵母菌株的26S rDNA基因片段序列与数据库中的假丝酵母(Candida sp.)同源性100％。因此将获得的不能利用分解赤藓糖醇但能良好的利用分解甘油、甘露醇、阿拉伯糖醇、核糖醇以及麦芽糖的酵母命名为Candida sp.。

[0044] 将分离出的酵母(Candida sp.)细胞梯度稀释，涂布在驯化培养基上，培养基成分为：赤藓糖醇母液333克/升，酵母粉25克/升，琼脂20克/升，pH5.0。在30℃培养5天。挑取菌落大的菌落再梯度稀释，涂布在驯化培养基上，在30℃培养5天。依次重复50次，获得适应高浓度赤藓糖醇母液的菌株，命名为Candida sp.SJTU828，并保藏在中国普通微生物保藏中心，获得的保藏号为CGMCC No.7323。

[0045] 图1为酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在含不同多元醇或麦芽糖的基本培养基上的生长情况；由图1可以看出，获得的酵母不能利用赤藓糖醇，但均能利用甘油、甘露醇、麦芽糖、核糖醇、阿拉伯糖醇，而赤藓糖醇母液中存在甘油、核糖醇、麦芽糖、甘露醇以及阿拉伯糖醇。因此利用该菌株发酵净化赤藓糖醇母液能够将母液中的甘油、核糖醇、麦芽糖、甘露醇以及阿拉伯糖醇分解利用，达到富集赤藓糖醇的目的。

[0046] 图2是(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在固体培养基上的菌落形态图，由图2可知，表面有褶皱，菌落边缘锯齿状，中间突起，淡黄色；

[0047] 图3是(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在0倍显微镜下的细胞形态图；由图3可知，细胞有卵圆形，有丝状两种形态。[0048] 实施例2、赤藓糖醇母液的高效液相分析与成份分析[0049] 将赤藓糖醇母液用去离子水稀释20倍并过0.2微米的滤膜，取50微升进行HPLC分析，使用的色谱条件为：温度70℃，流动相为去离子水，流速为1.0ml/min。使用的分析色谱柱为Shodex SP0810型号的分析柱，检测器为示差折光检测器。赤藓糖醇母液的高效液相

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说 明 书

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分析图谱如图4A所示，其中7.3min的峰物质是低聚麦芽糖。分别收集出峰时间为13.7min以及18.8min的峰，冻干，加水溶解进行高效薄层分析，用各种多元醇标准品进行对比，其成分分析鉴定示意图分别如图4B、图4C所示，可知13.7min的峰除含有赤藓糖醇目的多元醇外，还含有少许的核糖醇以及少许的甘油；而18.8min的峰含有2种含量几乎相同的多元醇(2个显色斑点的亮度基本相同)，分别是阿拉伯糖醇与甘露醇。[0050] 实施例3、酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在250ml摇瓶中发酵净化赤藓糖醇母液[0051] 制备发酵培养基，成分为：赤藓糖醇母液用自来水稀释1倍(即加入等体积的水)，加入质量体积百分比为3.0％酵母粉，调节pH5.0，灭菌。冷却后将菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323接入含20ml发酵培养基的250ml的摇瓶中(为了增加溶氧，在摇瓶底部加入钢丝圈)，在25℃，250转/分钟条件下发酵净化。定时取样进行HPLC分析，结果如图8所示，其中保留时间7.3min的物质为低聚麦芽糖，保留时间为13.7min的物质为赤藓糖醇，保留时间为18.8min的物质为阿拉伯糖醇与甘露醇；由图5中A、B、C图的对比可知，酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在赤藓糖醇母液中发酵净化20小时将甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解，赤藓糖醇的纯度由发酵0时的42％提高到发酵结束的72％。

实施例4、酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在1000ml摇瓶中发酵净化赤藓糖醇母液[0053] 制备发酵培养基，成分为：赤藓糖醇母液用自来水稀释3倍(在赤藓糖醇母液中加入2倍体积的水)，加入质量百分比为1.0％酵母粉与0.5％的玉米浆干粉，调节pH7.0，灭菌。冷却后将酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323接入含200ml发酵培养基的1000ml的摇瓶中(为了增加溶氧，在摇瓶底部加入钢丝圈)，在35℃，200转/分钟条件下发酵净化。定时取样进行HPLC分析，结果如图6所示，其中保留时间7.3min的物质为低聚麦芽糖，保留时间为13.6min的物质为赤藓糖醇，保留时间为18.8min的物质为阿拉伯糖醇与甘露醇；由图6中A、B、C图的比较可知，酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在赤藓糖醇母液中发酵净化20小时将甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解，赤藓糖醇的纯度由发酵0时的42％提高到发酵净化20小时结束时的71％。[00] 实施例5、酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在5升发酵罐中发酵净化赤藓糖醇母液[0055] 制备发酵培养基，成分为：赤藓糖醇母液稀释5倍(即在赤藓糖醇母液中加入4倍体积的水)，加入质量百分比为0.5％酵母粉，0.5％玉米浆干粉，0.1％磷酸二氢铵，调节pH3.5，灭菌。冷却后将酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323接入含3500ml发酵培养基的5升的发酵罐中(溶氧不足时通入氧气，使得溶解氧在20％以上)，在28℃，500转/分钟条件下发酵净化。定时取样进行HPLC分析，酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在18小时内将甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解，赤藓糖醇的纯度由42％提高到78％。

[0052]

实施例6、酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在30升发酵罐中发酵净化赤藓糖醇母液[0057] 制备发酵培养基，成分为：赤藓糖醇母液稀释10倍，加入质量百分比为0.2％酵母

[0056]

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浸膏，调节pH5.5，灭菌。冷却后将酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323接入含20升发酵培养基的30升的发酵罐中(溶氧不足时通入氧气，使得溶解氧在20％以上)，在35℃，前期10小时100转/分钟条件下发酵净化，后期10小时500转/分钟条件下发酵净化。定时取样进行HPLC分析，酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在20小时内将甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解，赤藓糖醇的纯度由42％提高到76％。实施例7、酵母菌种(Candida sp.SJTU828)C6MCC No.7323在150升发酵罐生物净化赤藓糖醇母液[0059] 制备发酵培养基，成分为：赤藓糖醇母液用自来水稀释2倍，加入质量百分比为2.5％酵母粉，0.5％玉米浆干粉，调节pH5.5，150升发酵罐装入100升发酵培养基，灭菌。冷却后将酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323入此发酵罐中，在32℃，300转/分钟，通气量10立方米/小时的条件下发酵净化。发酵到20小时时取样进行HPLC分析，结果如图7A所示，酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323能够在20小时内将甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解，赤藓糖醇的纯度由42％提高到75％。[0060] 实施例8、酵母菌种(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323在30,000升发酵罐生物净化赤藓糖醇母液[0061] 制备发酵培养基，成分为：赤藓糖醇母液用自来水稀释3倍，加入质量百分比为0.5％酵母粉，0.5％玉米浆干粉以及0.2％磷酸二氢铵，调节pH6.0。30,000升发酵罐装入21,000升发酵培养基，灭菌。冷却后将酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323接入此发酵罐中，在30℃，120转/分钟，通气量240立方米/小时的条件下发酵净化。发酵到20小时时取样进行HPLC分析，HPLC分析结果如图7B所示，酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323能够在20小时内将甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解，赤藓糖醇的纯度由42％提高到73％。[0062] 实施例9、酵母菌种(Candida sp.SJTU828)C6MCC No.7323在200,000升发酵罐生物净化赤藓糖醇母液[0063] 制备发酵培养基，成分为：赤藓糖醇母液用自来水稀释2倍，加入质量百分比为1.0％酵母粉，0.5％玉米浆干粉，调节pH5.0，200,000升发酵罐装入140,000升发酵培养基，灭菌。冷却后将10,000升酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323种子液接入此发酵罐中，在30℃，120转/分钟，通气量1000立方米/小时的条件下发酵净化。发酵到20小时时取样进行HPLC分析，酵母(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323能够在20小时内将甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解，赤藓糖醇的纯度由42％提高到76％。

[0058]

10,000升酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323的种子液是通过下面的

方法逐步培养得到：

[0065] 将酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323的种子从培养好的茄形瓶中刮下接种到含500毫升上述发酵培养基的2升的摇瓶中，在32℃、200转/分钟的摇床中培养36小时，再将此摇瓶中的500毫升培养液接种到含100升上述发酵培养基的150升发酵罐中，在30℃、150转/分钟、通气量每小时10立方米条件下培养24小时。再将此100升培养液接种到含1500升上述发酵培养的2000升发酵罐中，在30℃、150转/分钟、通气量每小时80立方米条件下培养24小时。再将此1500升培养液接种到含10,000升上述发酵培

[00]

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养基的15,000升的发酵罐中，在30℃、150转/分钟、通气量每小时150立方米条件下培养24小时，得到10,000升种子液。[0066] 实施例10、酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323批量补料发酵净化赤藓糖醇母液[0067] 本试验在30,000升发酵罐进行。先配制发酵培养基(成分为：赤藓糖醇母液用自来水稀释3倍，加入质量百分比为1.5％酵母粉，1.0％玉米浆干粉以及0.5％磷酸二氢铵，调节pH7.0，灭菌。30,000升发酵罐盛21,000升发酵培养基，接入2,000升(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323酵母种子液，在30℃，120转/分钟，通气量200立方米/小时的条件下发酵净化。定时检测赤藓糖醇纯度，当甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解后从中放出5,000升发酵净化液，再补入5,000升赤藓糖醇母液，继续发酵净化。定时检测赤藓糖醇纯度，当甘露醇、阿拉伯糖醇分解，低聚麦芽糖也基本被分解后又放出5,000升发酵净化液，再补入5,000升赤藓糖醇母液与20公斤的玉米浆干粉，又继续发酵净化。依次重复5次。最终30,000余升赤藓糖醇母液得到发酵净化，高效利用了发酵设备与节约了发酵时间。[0068] 实施例11、从赤藓糖醇母液生物发酵净化液中提取结晶赤藓糖醇以上实施例3～11所述的赤藓糖醇母液是指，酵母发酵葡萄糖合成赤藓糖醇的发酵液经过多次结晶赤藓糖醇后，不能再将赤藓糖醇结晶出来的颜色深、粘稠、固形物含量在30％～60％的液体，该液体除了含有赤藓糖醇外，还含有其它的多元醇以及其它大分子的物质，这些多元醇包括甘油、核糖醇、甘露醇、阿拉伯糖醇，大分子物质包括低聚麦芽糖、色素等，所述赤藓糖醇母液中赤藓糖醇的含量在10～30％(质量/体积百分比)；所述的酵母发酵净化是指酵母菌株(Candida sp.SJTU828)CGMCC No.7323将赤藓糖醇母液中除了赤藓糖醇以外的杂质(其它多元醇以及低聚糖或者色素)分解代谢并富集赤藓糖醇的过程。以上实施例4～11中任意赤藓糖醇母液生物净化结束后，依次通过除菌、脱色、浓缩、结晶、精制的过程，可得到纯度99％以上的白色赤藓糖醇晶体。具体包括如下步骤：[0070] 步骤一、发酵净化结束后通过离心或者膜过滤的方法将酵母细胞与发酵液分离，并通过纳滤的方法将分子量大于1000道尔顿的大分子粘性物质进行分离去除，得到澄清透明的发酵液；[0071] 步骤二：在每100毫升上述澄清透明的发酵液中加入1～5g的活性炭，在60℃～85℃条件下进行脱色，得到无色或者浅色的发酵液；[0072] 步骤三：将步骤二得到的无色或浅色的发酵液在70℃以上浓缩到固形物含量为50％～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以2～5℃/h的速率冷却降温直到温度降到10℃以下，在起晶点温度下加入质量/体积百分比为0.1～2％的赤藓糖醇晶体诱导成晶；该质量/体积百分比指的是每100毫升所述富含赤藓糖醇的糖浆中加入0.1～2g的赤藓糖醇晶体；

[0073] 步骤四：采用离心的方法将晶体与糖浆分离，得到白色或者浅黄色的赤藓糖醇粗晶体与赤藓糖醇二次母液，晶体用温度为10℃以下的冷水清洗一次；

[0069]

步骤五：将上述赤藓糖醇粗晶体重新精制；[0075] 精制的方法为：用去离子水溶解晶体，加入质量体积百分比为0.1％～5％的食品级活性炭，在60℃～85℃条件下搅拌脱色30分钟～3小时；板框过滤分离活性炭得到无

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色的赤藓糖醇糖液；再将该糖液浓缩到固形物为20％～30％，分别进行阴离子树脂(型号201)与阳离子树脂(型号001)离子交换，电导率降到100μs以下后再浓缩到固形物含量为50％～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以每小时2℃～5℃的速率冷却降温直到温度降到10℃以下，在起晶点温度(起晶点温度是指晶体开始形成时的温度，在此时外加入赤藓糖醇晶体有助于糖浆中的赤藓糖醇结晶形成)下加入质量百分比为0.1％～2％的赤藓糖醇晶体诱导成晶；该质量/体积百分比指的是每100毫升上述富含赤藓糖醇的糖浆中加入0.1～2g的赤藓糖醇晶体；[0076] 步骤六：采用离心的方法将晶体与糖浆分离，得到白色的赤藓糖醇精制晶体与赤藓糖醇三次母液，晶体用温度为10℃以下的冷水清洗一次，干燥晶体；[0077] 步骤七：将步骤四得到的赤藓糖醇二次母液与步骤六得到的赤藓糖醇三次母液合并，再浓缩到固形物含量为50％～80％，得到富含赤藓糖醇的糖浆，以每小时2℃～5℃的速率冷却降温直到温度降到10℃以下，在起晶点温度下加入质量百分比为0.1％～2％的赤藓糖醇晶体诱导成晶；该质量/体积百分比指的是每100毫升所述富含赤藓糖醇的糖浆中加入0.1～2g的赤藓糖醇晶体；得到的晶体再按照步骤五的方法进行精制得到白色的赤藓糖醇晶体；

步骤八：按照国家标准(GB204-2011)的要求进行检验，合格后包装成品。

[0079] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

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图4

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图5

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图6

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图7

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