双黄连片的微生物限度检查法的建立

·制药技术·39

双黄连片的微生物限度检查法的建立

董超琪

（泰州市食品药品检验所，江苏泰州 225300）

【摘要】目的 研究建立双黄连片的微生物限度检查法。方法 以2015年版四部通则微生物限度检查法为参考，采用常规检测法、培《中国药典》养基稀释法及薄膜过滤法三种检测法对双黄连片进行微生物限度检查，对部分试验菌株的回收比值进行测定。结果 双黄连片具有较好的抑菌活性，常规法无法消除抑菌活性，试验菌株回收比值较低，不符合要求且无法真实反应污染情况，培养基稀释法及薄膜过滤法在金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉的回收实验中，均符合回收比值要求，但薄膜过滤法各细菌、真菌的回收比值均较培养基稀释法高宜优先选择薄膜过滤法，培养基稀释法效果次之，一般不选用常规检测法。。结论 双黄连片的微生物限度检查法的建立，（P＜0.05）【关键词】双黄连片；微生物限度检查法；培养基稀释法；薄膜过滤法

中药制剂是现今临床、教学及各类研究试验中较为常用的一

类药品，医院制剂及成方制剂的种类繁多，覆盖临床诊疗的各领域，较受医疗人员、患者尤其是慢性疾病患者的青睐[1]。微生物限度检查法是评价中药制剂质量及安全性的重要手段，主要检查项

目为染菌量及控制菌[2]

，

而微生物限度检查法建立的目的是为相关药品提供完善规范适用的参考依据及方法，以科学可行的办法

明确中药制剂的抑菌活性及抑菌效力[3]

，

提高中药制剂使用的有效性及安全性。双黄连片以连翘、金银花及黄芩等为主要组分，具有较高的抑菌、解毒、清热的功效，本次研究为建立双黄连片的微生物限度检查方法，采用常规法、培养基稀释法及薄膜过滤法对菌株的回收比值进行测定，以获取结果更为精准可靠的方法。1 实验材料

1.1 实验样品：双黄连片。1.2 培养基及缓释剂：pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、0.9%无菌氯化钠溶液。

1.3 实验菌株：

金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉。

1.4 实验设备：

集菌仪，恒温培养箱、生化培养箱、高压蒸汽灭菌仪，电子天平，薄膜过滤器，生物安全柜等。2 方法和结果

2.1 供试液制备取双黄连片10 g，置入100 mL的pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液内，用振荡器振荡至双黄连片完全与缓冲液溶解，制成样本与缓冲液比例为1∶10的供试液，所有操作的设备均保证无菌，根据双黄连片的批次进行编号，备用。

2.2 对照菌液制备

制备金黄色葡萄球菌，制备方法为分别量取10 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液置入不同编号的无菌试管内，取斜面勾取金黄色葡萄球菌培养物，置入已编号的第一个无菌试管内，碾碎后溶解并振荡均匀，制备成初始菌悬液，用移液管量取1 mL初始菌悬液置入第二个已编号的无菌试管内，振荡均匀制成10-1稀释菌悬液，重复操作直至制成浓度为10-7的稀释级菌悬液，即每毫升的菌含量为50～100 cfu的菌悬液。遵上述操作依次制备白色念珠菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉的稀释级菌悬液。

2.3 回收比值测定2.3.1 常规检测法

用无菌移液管分别量取1 mL的不同种类的菌悬液及供试液，移入无菌培养皿，其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌悬液的培养皿倾注15 mL胰酪大豆胨琼脂培养基，白色念珠菌菌悬液的培养皿倾注15 mL沙氏葡萄糖琼脂培养基，其中菌液组取相应菌液1 mL倾注相

应琼脂培养基，金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆

菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉的培养温度为35℃～37℃，培养时间为48 h，白色念珠菌培养温度为25℃～27℃，倒置培养，培养时间为72 h。所有培养基均在每培养24 h即逐日进行菌落数的计数，最后结果取均值。

2.3.2 培养基稀释法

用无菌移液管吸取供试液4 mL，平均置入20个无菌培养皿中，即每个培养皿的供试液均为0.2 mL，每五个培养皿置入同种菌悬液，各1 mL，其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌悬液的培养皿倾注15 mL胰酪大豆胨琼脂培养基，白色念珠菌菌悬液的培养皿倾注15 mL沙氏葡萄糖琼脂培养基，混合均匀后前五种置入35℃～37℃左右的培养箱中培养48 h，白色念珠菌置入25℃～27℃左右的培养箱中培养72 h，所有培养基均在每培养24 h即逐日进行菌落数的计数，最后结果取均值。

2.3.3 薄膜过滤法

用50 mL左右的pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗薄膜过滤器，用无菌移液管分别吸取1 mL供试液及1 mL菌悬液注入薄膜过滤器中，用100 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液进行抽滤，直至过滤器中的液体被滤尽，取薄膜菌面朝上置入胰酪大豆胨琼脂培养基中，其中金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉菌悬液的薄膜置入营养琼脂培养基中央，置入35℃～37℃左右的培养箱中培养48 h，白色念珠菌菌悬液薄膜置入沙氏葡萄糖琼脂培养基中央，置入25℃～27℃左右的培养箱中培养72 h，均在每培养24 h即逐日进行菌落数的计数，最后结果取均值。

根据上述不同检测法对双黄连片进行微生物限度检查，其中菌液组的制备同上述操作但不添加供试液，对照组的制备同

上述操作但不添加菌悬液[4]

。就上述三种检测法的的平均菌属及回收比值进行统计。回收比值＝（实验组平均菌数-对照组

平均菌数）/菌液组平均菌数[5]

。

表1：双黄连片常规检测法实验统计

菌液平均菌数（cfu/mL）

实验组对照组菌液组回收比值金黄色葡萄球菌24.08065.460.37大肠埃希菌41.53072.340.57枯草芽孢杆菌8.79057.730.15白色念珠菌56.83059.840.95铜绿假单胞菌

37.49048.290.78黑曲霉

50.57

0

61.47

0.82

由表1结果可见，双黄连片对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用较强，对白色念珠菌的抑制作用最弱，因双黄连片具有抑菌活性，微生物限度检查中的常规检测无法消除其抑菌

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中国处方药 第17卷 第2期

·药事管理·

ICH-GCP基本原则分析与启示

郑航

（ 重庆医科大学药学院，重庆 400016）

【摘要】ICH-GCP是药品国际注册中共认的GCP。ICH-GCP列出的13条基本原则是GCP的科学性和伦理性原则的集中体现，是ICH-GCP的精华所在。随着我国药品审评审批制度改革的深入推进，我国GCP与ICH-GCP全面接轨已经是大势所趋。本文对ICH-GCP的13条基本原则进行全面解析，以期从中得到对我国GCP发展与临床试验实践有益的启示。【关键词】ICH-GCP，GCP；基本原则；启示

Chongqing 400016， China.Analysis and inspiration of the basic principles of ICH-GCP ZHENG Hang. Pharmacy College of Chongqing Medical University，

ICH-GCP is the recognized commonly GCP in drug international registration. The 13 basic principles of ICH-GCP epitomize the scientific 【Abstract】

and ethic nature of GCP and are the essence of ICH-GCP. With the deepening of the reform of drug registration system， that totally connecting China’s GCP with ICH-GCP is the general trend of development. The purpose of this study are to systematic analyze the 13 basic principles of ICH-GCP， and to get the inspiration for the improvement of China’s GCP and clinical trail practice.ICH-GCP；GCP；Basic principle；Inspiration【Key words】

药物临床试验质量管理规范 GCP）的（Good Clinical Practice，

目的是确保药物临床试验中受试者的权益得到保护、试验过程规范以及结果真实可靠。伦理性和科学性是GCP的两大核心理念。

ICH-GCP是药品国际注册中临床试验要求遵循的GCP。ICH-GCP的E6（R1）版于1996年发布，使用了20年时间，极大地促进了GCP理念和标准化实践在全世界的普及。该版本GCP

这13条原则是GCP的科学开宗明义的列出了13条基本原则[1]，

性和伦理性原则的集中体现，是ICH-GCP的精华所在。2016年发布的ICH-GCP的E6（R2）版完全继承了E6（R1）版的这13条原则，仅对其中两条原则的内容做了适应新形势的增补[2]。随着我国药品审评审批制度改革的深入推进，以及我国参

与国际多中心临床试验数量的不断增加，进一步提升我国GCP理念以及实践水平成为当务之急，我国GCP与ICH-GCP全面接轨已经是大势所趋。本文对ICH-GCP的E6（R2）版的13条基本原则进行全面解析，从中得到对我国GCP发展与临床试验实践有益的启示。1 基本原则分析

临床试验的实施应符合源自赫尔辛基宣言基本原则一：

的伦理原则，与GCP 和适用管理要求一致。

本条原则是药物临床试验实施的法规依据，包括赫尔辛基

表2：双黄连片培养基稀释法实验结果统计

菌液金黄色葡萄球菌大肠埃希氏菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌铜绿假单胞菌黑曲霉

平均菌数（cfu/mL）

实验组48.8457.3126.8460.3942.5953.66

对照组2.371.450000

菌液组72.4770.3944.5765.1050.7159.73

回收比值0.640.790.600.930.840.90

表3：双黄连片薄膜过滤法实验结果统计

菌液金黄色葡萄球菌大肠埃希氏菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌铜绿假单胞菌黑曲霉

平均菌数（cfu/mL）

实验组62.4971.8545.2961.3244.8155.82

对照组2.311.960000

菌液组69.0377.4660.4463.5251.0760.71

回收比值0.870.900.750.970.880.92

菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希氏菌的回收比值均较低，显著低于0.7，白色念珠菌的回收比值较高表明双黄连片对白色念珠菌的抑菌作用较弱，常规检测法无法准确检测样本中的菌量，准确率较低。运用培养基稀释法及薄膜过滤法能够显著提高回收比值，但培养基稀释法中金黄色葡萄球菌的回收比值不足70%，

三种检查法综合比较，无法完全达到我国药典中的相关规定[7]，

薄膜过滤法对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和黑曲霉的回收比值分别为0.87、0.90、0.75、0.97、0.88及0.92均显著高于0.7，且均显著高于常规检测法及培养基稀释法，对消除双黄连片供试品中的抑菌活性的效果最优，细菌真菌等微生物检出率最高，在反应双黄连片这类中药制剂质量及安全性方面具有切实可靠的优势。参考文献

[1] 杨育儒，沈秋莲，王庆芬. 六种中药制剂微生物限度检查方法验证. 西部中医药，2017，30（11）59-61.：

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 北京：中国医药（四部）科技出版社，2015：140-149.

[3] 周俊，唐蕾. 利尿消炎合剂微生物限度检查方法的验证. 海峡药学，2015，27（8）61-63.：

王菲. 3种中药制剂微生物限度检查法验证. 临床合理用[4] 唐喆，

药杂志，2016，9（23）21-22.：

[5] 陈克玲，李晓强，吴玉兰，等. 药品微生物检验结果的相关影响要素分析. 中国医药指南，2017，15（12）290-291.：

[6] 王沁馨，周剑. 双黄连口服液微生物限度检查法的验证. 中国药房，2008，19（27）2125-2126.：

[7] 张乔，张琦，李静，等. 双黄连口服液与颗粒剂微生物限度检查方法的研究. 中医药信息，2018，35（2）53-56.：

活性，对检测结果影响较大，而培养基稀释法及薄膜过滤法能够

对双黄连片样本中的抑菌活性进行有效消除，由表2及表3结果可见，大肠埃希氏菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和黑曲霉的回收比值较高，但薄膜过滤法的各菌类的回收试验结果示回收比值均高于培养基稀释法。（P＜0.05）3 讨论

双黄连片是一类具有多种抑菌成分的中药制剂，具有较强的抑菌作用，根据我国药典的规定，在微生物限度检查时须先

本次研究分别就三种常用的微生物限度检消除其抑菌活性[6]，

查法进行了实验分析，结果显示，常规检测法中金黄色葡萄球