生物芯片进展

化　学　进　展

PROGRESSINCHEMISTRY

Vol.21No.11

　Nov.,2009

生物芯片进展

肖守军

33

3

　陈　凌　许　宁

(南京大学化学化工学院配位化学国家重点实验室南京微结构国家实验室　南京210093)

摘　要　生物芯片是近20年来生物技术领域发展迅速和获得重大突破的高新技术,本综述介绍了经典

的平铺生物芯片(DNA和蛋白质芯片)之后,重点介绍了近十年来发展的新的生物芯片的概念和内容:质谱为读出机制的表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI)芯片、高通量DNA测序技术、基于胶体光子晶体的微球高通量生物检测技术、三维阵列生物芯片技术和微流控等生物芯片技术。同时描述了各种生物芯片技术的优点、应用范围和有待解决的问题,最后展望了生物芯片技术的未来。

关键词　生物芯片　读出机制　蛋白质芯片　三维阵列芯片　微球高通量检测　高通量DNA测序　微流控生物芯片

中图分类号:O65;O629.7　文献标识码:A　文章编号:10052281X(2009)1122397214BiochipDevelopment　ChenLing　XuNing

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,StateKeyLaboratoryofCoordinationChemistry,NanjingNationalLaboratoryofMicrostructures,NanjingUniversity,Nanjing210093,China)

XiaoShoujun

33

Abstract　Biochipisoneofthebreakthroughtechnologiesdevelopedintherecenttwentyyears.InthisreviewwefirstintroducetheplanarDNAandproteinmicroarrays,thenfocusonthenewlydevelopedhightechnologiesofSELDI(surfaceenhancedlaserdesorptionΠionization)biochip,highthroughputDNAsequencing,highthroughputphotoniccrystalmicro2beadbio2coding,threedimensionalgel2padbiochip,andmicrofluidicbiochip.Wedescribetheadvantagesofeachtypeofbiochips,limitsofitsapplications,andproblemstobesolved.Thefutureofbiochiptechnologiesisprosperous.

Keywords　biochip;read2outmechanism;proteinmicroarray;threedimensionalbiochip;highthroughputmicro2beadbio2coding;highthroughputDNAsequencing;microfluidicbiochip

4　Biochipread2outmechanism4.1　Fluorescence4.2　Massspectroscopy

4.3　Electricalread2outmechanism5　SELDImassproteinbiochip6　HighthroughputDNAsequencing

7　Highthroughputphotoniccrystalmicro2beadbio2coding

8　Threedimensionalbiochip

Contents

1　Introduction2　DNAmicroarray

2.1　IntroductiontoDNAmicroarray2.2　PreparationofDNAmicroarray3　Proteinmicroarray

3.1　Introductiontoproteinmicroarray3.2　Preparationofproteinmicroarray

　　收稿:2009年5月

　3国家自然科学基金项目(No.20827001)资助33Correspondingauthor　e2mail:sjxiao@nju.edu.cn

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8.1　32Dgel2padmicroarray8.2　32Dporoussiliconbiochip9　Microfluidicbiochip10　Outlook

1　生物芯片简介

　　生物芯片是20世纪80年代末迅速发展起来的

一项高新生物技术,它的内涵是指通过机械手臂点样技术或微电子光刻技术在平方厘米量级的固相载体表面构建成千上万个不同探针分子微点阵的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、核酸、蛋白质、糖类及其他生物组分准确、快速和大信息量的检测。出现之初,它被认为是继大规模集成电路芯片之后又一次具有深远意义的科学技术革命,被Science杂志在1998年和2008年两度评为年度十大科技突破之一。美国著名的财经杂志Fortune在1997年3月对其重大意义作了如下阐述“:微处理器在本世纪使我们的经济结构发生了根本改变,给人类带来了巨大的财富,改变了我们的生活方式。然而,生物芯片给人类带来的影响可能会更大,它可能从根本上改变我们的医学行为和生活质量,从而改变世界的面

[1]

貌”。

经过了十多年的发展,人们已将生物芯片的定义外延扩展到高通量筛选(highthroughputscreening,HTS)和测试的生物技术。以生物芯片为代表的高通量测试技术包含以下特征:高通量、微型化和自动化。详细来说,它以固体微板或微珠作为探针分子载体,平行地在厘米尺度的芯片上构建成百到千上万个的微阵列,在分子和细胞水平上利用探针分子与目标生物分子的相互作用来识别和捕获目标物,它将生命科学中许多不连续的常量操作过程(如样品制备、生化反应、富集和检测步骤)集成到芯片上并使这些分散的过程连续化和微型化,以实现对大量生物样品和测试指标进行快速和并行处理的目的。所有的微阵列样品点在同一时间用灵敏快速的测试方法进行检测和采集数据,整个实验过程主要由自动化操作系统执行和完成,并用计算机软件对数据进行分析处理,最后与相应的标准数据库比对得出结论,生物芯片技术是以上所述的这样一个整体技术体系。

生物芯片的商业模式一般有两种方式,一种是商业公司构建了标准的DNA或蛋白质(图1)的文库芯片或根据顾客需求的文库芯片,这些探针文库分子被固定在芯片表面,芯片能被储藏和运输到客户

手里,客户在使用过程中,使芯片微点阵上的探针分子与待测样品溶液里的目标分子相互作用或杂交,目标分子本身带有标记信号或再用标记了信号的信标分子与目标分子作用,目标分子的信号被显示和放大从而被读出,达到可定性和定量地检测被捕获的目标分子的目的,从而用于基因组和蛋白组的分析、疾病的诊断和药物的筛选等。另一种模式是商户只是提供活化的载片表面如氨基载玻片等,客户使用自动点样仪制备探针阵列芯片并进行检测,这种模式下,主要的工作由客户承担。

生物芯片最常用的分类方法有下面几种(图2):根据其功能可分为基因芯片(包括DNA和RNA芯片)、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等;根据

3D胶垫式其物理结构可分为微点阵(或阵列)芯片、

微阵列芯片、微珠芯片、微流控(microfluidic)芯片和芯片实验室(labchip)等。由于各种分类相互也有交叉,在这篇综述文章中,首先介绍生物芯片中最基础的基因芯片和蛋白质芯片的基本原理和概念,接下来重点介绍一些新型生物芯片的研究进展。

图1　DNA(左)和蛋白质(右)的三维结构示意图

Fig.1　SchematicthreedimensionalstructuresofDNA(left)andprotein(right)

图2　各种不同类型的生物芯片示意图

Fig.2　Schematicstructuresofdifferentbiochips

2　微点阵DNA芯片

2.1　DNA芯片介绍

DNA(或基因)芯片的基本原理是DNA分子的

杂交,这是由DNA分子本身所独有的性质决定的。

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每一个核酸分子是由数个或更多的碱基单体组成的

线性大分子结构。著名的Watson和Crick的DNA双螺旋结构阐明了核酸分子中的碱基具有相互配对的特性。当一个核酸分子的碱基序列与另一个核酸分子的碱基序列互补时,那么这两个核酸分子的互补碱基就一一对应地结合起来并在生理条件下稳定地存在,这就是DNA分子的杂交。

DNA芯片采用的微阵列技术使得一次性高通量和平行检测成为可能。检测基因表达的经典方法主要有印迹杂交(Southern和Northern)、差异杂交、RT2PCR和原位杂交等技术。这些方法都只能对少

期工作。

DNA芯片的制作主要可分为两大类。一类是目前通用的机械手臂自动点样法(即P.Brown法)。将预先制备好的DNA文库里的微量探针样品,通过机械手臂的微量接触点样装置或微量自动喷墨点样仪规则地分布在固体载片上,DNA探针分子通过物理吸附或化学键合的方式被固定在载片上来制备DNA点阵芯片。此种方法适用的探针可以是整个基因(长度几百至上千个碱基,从PCR制得)或者是较长链的寡核苷酸(长度几十至上百个碱基合成制得)。运用这种方法制作的探针密度可达到几百个点Πcm。此方法的优点是利用了天然的DNA文库,因此具有更强的亲合能力和特异性杂交,缺点是每个样品在微阵列制作前都需要合成、纯化和保存等。另一类是在半导体硅片或玻璃片上,以原位聚合的方法合成寡核苷酸阵列,即前面介绍的Affymetrix公司Fodor发明的光导合成法(如图3)。在经过处理的载玻片表面铺上一层硅烷偶联剂的连接分子,分子的末端羟基用光敏保护基因X封闭。利用微电子光刻技术的平板照相技术对芯片进行紫外曝光,曝光区域光敏保护基团X离去,并产生游离羟基,利用DNA固相化学反应在游离羟基区域加上带有基团X的第一个核苷酸,清洗和干燥后,利用光刻的套刻技术可在芯片另外的特定位点进行另一核苷酸的加成。重复上述步骤,直至合成到所需的寡核苷酸链的长度为止

。这类原位合成法

一般适用于合成短链的寡核苷酸(长度大约在25个碱基左右)。该法的优点是能直接人为设计寡核苷酸序列,并将它们在线合成来制造芯片,或根据顾客的定制给出高密度的寡核苷酸芯片,若能保证合成中每一步的高精确度,可以最大限度地消除芯片之间的差异。运用这种方法制作的芯片理论上若产生

282μ1cm。但由于m大小的点阵,密度可高达10点Π

检测的限制,现在的实际制备密度与点样法相当。

[2,3]

2

数几个基因的表达进行分析。但生物体是一个复杂

的系统,需要对多个或整个基因组进行诊断和分析,DNA芯片的概念和发展适应了这一社会需求。

DNA芯片是生物芯片中最基础、研究开发最早、最为成熟和目前应用最广泛的产品,它是随着人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)的实施,伴随对基因组测序的需求应运而生的。1991年位于美国北加州硅谷的Affymetrix公司的Fodor发明了一种利用光刻技术在固相支持物表面上选择性地进行图案化光化学从而合成多肽的方法,并在此基础上于1993年设计出了平行制备多种寡核苷酸的

[3]

生物芯片。直至1996年底,该公司充分结合并灵活运用了集成电路的照相平板印刷、计算机控制、光化学、寡核苷酸合成、荧光标记、核酸探针分子杂交和激光共聚焦荧光扫描等高新技术,研制出世界上第一块商业化的DNA芯片。在此之前,美国斯坦福大学P.Brown教授的实验室发明了以机械自动手

[4]

臂点样在玻璃载片上的cDNA芯片,标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期。基因芯片技术被科学家们迅速应用于动植物和人类基因的研究领域,它们在核酸研究领域中得到了长足的发展,实现了部分商业化的过程。2.2　DNA芯片的制作

DNA芯片的制备过程是将已知序列的成千上万条寡核苷酸文库或cDNA探针文库规律地密集排列在生物芯片(如玻片和高分子膜等)上,然后将要研究的目标核酸序列(如DNA、RNA或cDNA)用荧光标记后,在芯片上与探针杂交,再通过激光共聚焦荧光显微镜或电荷耦合器件(CCD,chargecoupleddevice)对芯片扫描,并配合计算机系统分析,对每一个探针样品点上的荧光信号作出比较和检测,从而快速、准确地得出所需信息。设计、合成和纯化DNA探针文库是制作DNA芯片最繁琐和关键的前

[2]

图3　光导合成法原理的流程示意图

Fig.3　Schematicflow2chartforpreparationofaDNAmicroarraybyphotolithography

・2400・

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它的缺点也很明显,DNA固相合成在平板上的产率

远低于在树脂中的产率,因此原位合成法不能超过25个寡核苷酸的长度,实际上几个循环后的出错率就很大了,它的制作周期也较长,价格偏高,目前该技术已不被看好。蛋白质水平,因基因的蛋白质表达是动态的,在不同阶段基因表达蛋白质的开启和关闭也是科学家目前不能预测的,同时很多蛋白质的功能随翻译后修饰的不同而变化。因此要获得完整的生物信息,就有必要直接研究基因的表达产物———蛋白质,以了解人体的健康状况并进行诊断和治疗,蛋白质特殊的

[5]

功能和复杂性都有待探索和解释。

人类基因组大规模测序工作已经完成,功能基因组学和蛋白质组学成为当今生物学界的主要研究内容之一,蛋白质组学的研究迫切需要一种能够快速、准确、并行处理和检测蛋白质分子的方法。传统的酵母双杂交方法、Western印迹法、免疫印迹法(immunoblot)、酶联免疫吸附法(ELISA)等蛋白质科学常用技术存在着操作繁琐、费时费力、不能大规模并行处理样品的缺点。二维蛋白质电泳是目前公认的一次性大批量处理和检测蛋白质样品的通用方法和工具,但是操作也较复杂和耗时。而且,二维蛋白质电泳的最低检测限为1ngΠ点,被认为只能有效地分辨生物体中高丰度表达的蛋白质样品,而与很多疾病相关的重要蛋白质的表达量都比较低,不能被分辨出来;另外,二维蛋白质电泳虽然能根据蛋白质的分子量和结构将蛋白质分区,但不能精确确定蛋白质的分子量,电泳分离后的蛋白质条带还要进行进一步的质谱测定。而蛋白质芯片具有快速、准确和并行检测等优点,作为检测蛋白质存在和运动变化的高效工具,它将为人类社会急需的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、食品卫生及环境监测等领域带来变革。蛋白质芯片可以直接测定蛋白质的相对水平及与其他分子的交互作用情况,也能反馈出基因的活动情况,因而蛋白质芯片有着比基因芯片更加直接的应用前景。3.2　微点阵蛋白质芯片的制备

形成蛋白质微阵列图案的主要方法有:接触式自动点样法、非接触或喷墨式自动点样法、PDMS印

[6][7]

章法及光刻法。

微加工技术是人类迄今所能达到的精度最高的自上而下(top2down)的加工技术,光刻技术是其重要支撑手段之一。根据光刻过程中曝光所用的射线不同,光刻方式可分为紫外线光刻、X射线光刻、电子束光刻和粒子束光刻。无论用哪种射线和方式进行光刻,其工艺步骤大体是一样的,包括涂胶、前烘、曝光、显影、漂洗、坚膜等步骤。

考虑到蛋白质芯片的特殊要求,合适的基底材料应符合以下条件:尺寸精确、平滑、平整、均一、耐

3　微点阵蛋白质芯片

3.1　蛋白质芯片介绍

微点阵蛋白质芯片是由基因芯片技术直接发展

而来的,它是沟通基因组学和蛋白质组学的工具和桥梁,目前仍处于发展过程中。在生物体内,核酸分子(包括绝大多数的DNA和RNA)通常是机体存储和传递各种信号的载体,而最终具有执行功能的基本单元是核酸所表达出的蛋白质,核酸表达时根据机体的需求,产生在功能、结构和数量上都不尽相同的蛋白质。基因芯片虽能侦测体内细胞mRNA和DNA的变化,但不能侦测真正影响细胞生理状态的蛋白质。

如前所述,DNA是双螺旋结构并且严格遵守碱基配对原则(A2T,C2G)。磷酸根在螺旋的外侧构成两条方向相反的多核苷酸链骨架;碱基在螺旋内侧,两两对应。因此,DNA的结构是单一和稳定的,并具有高度的亲合性和特异性,配对DNA的作用位点是一一对应的,即使干燥储存也不会丧失活性。与DNA不同,蛋白质是高度复杂和精巧的分子。它是由一条或多条多肽链通过共价键(主要是二硫键)或非共价力结合而成的,氨基酸是其基本结构单元。蛋白质的结构非常复杂,主要包括以肽链线型结构为基础的一级结构,以及由肽链卷曲和折叠而形成的三维结构:蛋白质的二级、三级和四级结构。具有独特的三维结构和生物活性是蛋白质分子区别于非生物的有机和高分子最显著的特征。天然活性蛋白质都具有特征且稳定的三维结构,一旦这种三维结构遭到破坏,即使它的一级结构不变,蛋白质的生物功能也会完全丧失。因此,在制备蛋白质芯片时必须保持蛋白质的三维结构以保持其生物活性。由于蛋白质的类型多样,其亲合性和特异性也有很大的区别。另外,特定的蛋白质和生物体内的矿物质、水、排泄物、脂类分子及其他蛋白质混合在一起,浓度很低,在不同时期其丰度变化可达10个数量级。因此,要求检测手段具有非常高的灵敏度、特异性和大的动态响应范围。基因表达的研究告知:mRNA的丰度和蛋白质的表达没有必然联系,二者不是线性关系,基因芯片检测的结果不能告知生物体内的

第11期肖守军等　生物芯片进展

[8]

・2401・

受性强、荧光惰性、反应效率高和可结合性强。现

有的基底主要包括玻璃片或石英玻璃片、硅片、金膜、凝胶、滤膜及它们的衍生物等。芯片载体的低荧光背景能提高检测的灵敏度。玻璃片或石英玻璃片是普遍使用的固相基片,玻璃片表面形成点阵的方法主要是喷墨式或接触式自动点样,并且可以标准化及与大多数商业扫描仪兼容。但玻璃片会吸收部分紫外和可见激发光,发出干扰测定的二次荧光;石英玻璃片几乎没有二次荧光效应,但基片价格较高。基于性价比的原因,常用的基片还是玻璃片和高分子载片。另一方面,这类平铺的芯片的容量较小,结合蛋白质的能力及水分保持能力较差。为了避免蛋白质干燥,需要在样品缓冲液中按照一定比例加入甘油或在点样时使用加湿器保持环境的湿度。载片的表面并不能直接固定蛋白质,制备微阵列之前载片表面需经特殊处理,如多聚赖氨酸修饰或戊二醛表面活化。表面疏水的基片易于点样,同时水滴收缩形成大小一致的球状,从而构成均一的点阵。表面的活性基团用来物理吸附(如聚赖氨酸的静电吸附)和共价偶联蛋白质。黏附蛋白质的交联层一般由自组装的单分子膜构成,最熟知的单分子膜是硅烷偶联剂和多聚赖氨酸。不同的材质决定蛋白质的固定方式和检测方式。蛋白质固定到固相基片上有扩散、吸附、共价偶

[9]

联和亲合结合4种方式(图4)。

讲是一种弱连接,对保持相对自由的蛋白质的活性有一定的优势,但缺点也很多,比如吸附在疏水表面的蛋白质或蛋白质和固相基质间作用位点过多都容易导致蛋白质的变性,而且非常容易发生非特异性吸附。吸附的蛋白质的分布是随机的,固定不牢固,易被冲洗下来。

醛基、环氧基和活性交联剂的表面是通过共价偶联固定蛋白质的。共价连接的方式作用位点少,但作用力强、固定牢固、整体反应也容易控制。如果知道蛋白质分子的三级结构,就有可能实现定点修饰,使其生物活性部位向外,达到一种“定向”的效果,提高灵敏度。但如果连接的是活性位点,则蛋白质失活,而且选择性也比较差。例如通常用到的蛋白质内自由氨基的交联因绝大部分蛋白质含有多个氨基,不能确定哪个或者几个氨基被固定到基片上,交联后蛋白质的活性不能准确地确定,这很可能是很多商业芯片的测试结果不能很好地重复的原因。

水凝胶和琼脂糖凝胶表面构成了三维结构,它们可利用扩散作用来捕获蛋白质,特点是高结合容量、低噪声背景和无需蛋白修饰,水凝胶体系能够很好地保持蛋白质的三维结构从而保持蛋白质的活性,在下面的章节里还要专门讨论。

亲合结合主要是利用一些特定相互作用,比如Ⅱ

Ni2NTAΠhistag和biotinΠavidin等一些特异性强的相互作用系统。这种方式蛋白质的固定位点确定、固定强度适当、分布均一、蛋白质取向也能保证,故能保持蛋白质的活性,特异性作用强,噪声背景也很低。但这些特异性作用的蛋白质需要在表达时就进

Ⅱ

行标记,如与Ni2NTA作用的蛋白质需组氨酸标记,与抗生素作用的蛋白需用生物素标记等。在许多情况下,共价或非共价结合的亲合标签比直接固定蛋白质更具优势。亲合标签或抗原决定　　　　　　表1　蛋白质芯片常用的亲合标签[10]

Table1　Listofaffinitytagsforproteinmicroarray

[10]

图4　蛋白质固定的不同方式:扩散(左上)、吸附(右上)、共价偶联(左下)、和亲合结合(右下)[9]

Fig.4　Immobilizationofproteinswithdifferentapproaches:diffusion(upperleft),adsorption(upperright),covalent

[9]

binding(bottomleft),andaffinitybinding(bottomright)

亲脂基底(如尼龙和赛璐珞)及带正电荷的表面(如多聚赖氨酸)主要是利用吸附作用。物理吸附是固定蛋白质最简单的方式,主要作用力有疏水作用力、离子键、氢键和范德华力。吸附作用一般意义上

affinitytags

poly2aminoacid　poly2His　poly2lysine　poly2cysteinebiotinproteinGproteinA

recombinantfusionproteins　GST　MBP　TRX　GFP　poly2His

modeofattachmentnickelresin

amide&SchiffbaselinkagesthioetherlinkagestreptavidinantibodyFcantibodyFcantibodyanti2GSTanti2MBPanti2TRXanti2GFPnickelresin

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簇标签可以是多肽、聚合氨基酸(例如与镍结合位点

连接的多聚组氨酸,以氨基或席夫碱连接的多聚赖氨酸,与硫醚连接的多聚半胱氨酸)、完整的蛋白质(例如G蛋白、谷胱甘肽S转移酶或GST、绿色荧光蛋白质或GFP、硫氧还蛋白)、有机生物共轭体(例如

[10]

生物素)、一对偶合试剂或交叉连接子等(表1)。

2

合到微点阵芯片的样品点(约几十至几百μm)在激光激发下成为一个荧光发射透镜,使整个影像聚集,荧光通过一系列的反光镜、滤光片和晶体后与不要的光分开,然后被光电倍增管(PMT)转换成一种电信号进行检测。激光共聚焦扫描成像技术使得荧光

4　生物芯片读出机制

　　既然生物芯片的特征是高通量、微型化和自动化,这就要求它的读出技术也是高通量和快速的。目前使用最广泛的读出技术是荧光扫描;质谱检测技术的发展也非常迅速,已有多款质谱检测的生物芯片。除此之外,电信号和光信号也是生物芯片重要的读出技术。4.1　荧光扫描检测的原理

荧光是光致发光的结果,当特定波长的光子(单色激发光)被所照射的分子吸收后,分子的电子能级发生跃迁,而这些处于激发态的分子是不稳定的,在适当的条件下,这部分被吸收的能量又以辐射的形式释放出去,这就是光致发光。

荧光分析是用芯片里阵列的点阵所发出的荧光强度来测定试样里荧光物质的含量。在生物芯片的检测中,荧光强度F可以表示为:F=ΦIOKC,其中Φ是荧光效率(入射光的量子与出射荧光的量子之比),IO是入射光的强度,K为常数,C为目标分子的表面覆盖度。荧光强度与荧光物的表面覆盖度成正比,这样就可以定量地检测薄膜表面荧光物质的含量。荧光检测已经成为检测生物芯片最直观和方便的方法。生物芯片点阵捕获的目标分子在点阵上是均匀的,要得到目标分子的绝对含量(如Φ和K)是有一些困难的,故绝大部分的工作用了相对量来定量描述生物芯片的数据。为了能够得到与其他方法交叉验证的数据,内标法和标准曲线法是通常使用的定量分析方法。

在微阵列分析中,多色荧光标记可以在一个分析中同时对两个或多个生物样品进行多重分析,多重分析能大大地增加基因表达和突变检测结果的准确性,排除芯片与芯片间的人为因素。

荧光扫描检测技术主要有两种:CCD成像扫描仪和激光共焦扫描仪。CCD结构简单,一次成像,不需要二维移动平台,经济实惠,但分辨率低,视场也不够大。激光共焦扫描成像检测是目前的主流技术,采用激光作光源,光电倍增管检测。一旦荧光标记的样品和微点阵结合后,未结合的成分被洗去,结

为基础的数据获得和定量分析成为可能,快速的荧光检测技术是芯片检测技术的一次革命。4.2　质谱方法

质谱在研究物质组成和结构方面一直占有极其重要的地位,可以提供化合物的相对分子质量(Mr)及丰富的结构信息。传统的质谱离子化方法包括电子轰击和化学电离,不适于难挥发和热不稳定的强极性物质的测定,因而对生物大分子的测定无能为力。新的软电离技术的诞生,如快原子轰击(FAB)、电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离

-1-1

(MALDI),使得在μL的水平上可mol・L和nmol・

以准确分析分子量高达几万到几十万的生物大分子。将这些软电离技术与多级质谱相结合可以获得蛋白质和多肽分子的结构信息,因此在蛋白质和多肽等大分子物质的分析领域中得到了广泛应用。目前蛋白质组学中常用到的一种质谱技术是电离飞行时间质谱(MALDI2TOF2MS)和由此演化而来的表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI2TOF2MS)。由于SELDI的特殊性,第5节专门分一节来描述。4.3　电化学分析方法和其他方法

安培检测法是根据待测物质在恒(或脉冲)电位工作电极上发生电化学反应所产生的氧化电流或还原电流对待测物质进行定量的检测方法,其灵敏度很高,具有一定的选择性;电导检测是根据带电组分对溶液电导率的贡献而进行检测的,理论上离子型组分均可进行电导检测。微流控和毛细管电泳芯片分析系统中常用电化学检测方法。Intel、Motorola和CombiMatrix等公司投资的生物芯片都是利用和电化学分析相关的技术来进行检测的。

其他的如光反射干涉谱、表面等离子共振、红外和拉曼光谱等在生物芯片的检测上都有文献报道。

5　SELDI蛋白质质谱芯片技术

　　表面增强激光解吸离子化(SELDI)蛋白质质谱芯片技术是Taylor医学院的Hutchens等发展起来[11]

的。作为SELDI芯片载体的材料必须是导电的,这样才不至于导致电荷的积累,实际上SELDI蛋白质质谱芯片是集亲合层析、富集、分离和检测于一体

第11期肖守军等　生物芯片进展・2403・

的技术。这种技术利用芯片载体(如硅、金、银等金

属)表面的化学修饰,将表面处理成化学类型或生物类型的芯片。化学类型的芯片表面如亲疏水型、阳离子交换型、阴离子交换型和金属离子螯合型等,根据蛋白质物理和化学性质的不同,芯片表面上的点阵选择性地从待测生物样品中捕获目标物,将其结合在芯片的亲合层析面上,经原位清洗和浓缩后,结合TOF2MS技术,对捕获的多肽或蛋白质进行质谱

[11,12]

分析。利用芯片表面修饰分子物理和化学性质的不同,对蛋白质分子进行分类和鉴定,如表面使用亲疏水的材料,则它吸附与之对应的表面亲或疏水的蛋白质。SELDI芯片有许多优点:它避免了复杂的样品预处理过程,可直接用于分析患者的血液、尿液、脑脊液、胸腔积液等体液以及细胞裂解液;样品

μ用量少,一般在015—15l或几百个细胞;可同时测定多个生物标记物,并用于发现一些低丰度和小分

子量的蛋白质;敏感性高,可达到1fmol量级;对疏水性蛋白质特别是膜蛋白有独特鉴定作用等。生物类型的芯片实质上是一些固定有特异性结合的蛋白质探针的点阵,特异性结合的生物分子作用类型如抗原2抗体、受体2配体、DNA2蛋白质、DNA2RNA等。它的优点是特异性高,可直接检测到未知的蛋白质,单克隆抗体芯片可替代WesternBlot,可以互补流式细胞仪不足的功能等。

美国芝加哥大学化学系的Mrksich教授领导的课题小组以贵重金属金、银和铂等为基底,结合自组装膜和膜上的生物特异性反应,用质谱技术检测了酶的活性等。图5显示了一种酶只对它的底物多肽

[13]

进行磷酸化。

图5　SELDI质谱技术用于检测酶的活性,图中,一个

proteinkinaseG的多肽底物被固定在自组装膜上的马来

酰亚胺官能团上(A),(B)为用质谱检测的该多肽的分子量(上图)和酶作用后多加了一个磷酸基团的多肽分子量

(下图),(C)固定了4个不同分子量多肽的样品的质谱(上图)和经酶作用后只有该酶的底物多肽(M4)被磷酸

6　高通量DNA测序技术

　　在基因芯片的基础上,科学家和一些公司合作,发展了高通量测序技术,该技术的典型代表是罗氏公司(Roche)的454测序仪(RochGSFLXsequencer),Illumina公司的Solexa基因组分析仪(IlluminaGenomeAnalyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABISOLiDsequencer)。高通量测序的基本原理是合成测序,与基因芯片的杂交测序相比,它省略了文库构建这一繁重的实验步骤。

图6是罗氏公司454测序仪合成测序原理的示意图。将被测模板DNA结合上通用的锚定接头,分离并一一对应固定到微珠或平板的特定区域,在特定的区域用乳液PCR扩增至百万倍后,加入测序试剂:如DNA引物和DNA聚合酶,然后依次加入4种

化的质谱[13]

Fig.5　Assayofenzymeactivitybymatrix2assistedlaserdesorptionΠionizationspectroscopy.ApeptideofthesubstrateofproteinkinaseGwaslinkedbymaleimidespeciesofaself2assembledmonolayerongoldandthenwasphosphorylatedbyanenzymePKGΠATP(A).Massspectraofthemonolayerbefore(B)andafter(C)theenzymereactionrevealthatthemassofthe

peptide2terminated

alkanethiol

increased

by

80Da,

correspondingtotheexpectedphosphorylation.Amulti2analyteassaywasperformedbyimmobilizingamixtureoffourpeptidesubstrates.Treatmentofthemonolayerwithcaseinkinase1resultedinphosphorylationofonlyasinglepeptide,whichwaseasilydetectedinthemassspectra

[13]

・2404・

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第21卷

脱氧核苷酸引物以及待测DNA为模板开始　　　　(dNTP)、

延伸,加入的一个dNTP是否在模板上延伸,可以用多种方法来测定,454测序仪使用了焦磷酸测序的发光方法来测定碱基的延伸,重复上述的步骤,就能够确定每一个片段的序列,最后将所有序列进行组

[14,15]

合,就可得到基因的序列。

Solexa的方法为克隆单分子阵列(clonalsingle

TM

moleculearray)技术,它不同于454测序仪的方法是将引物固定在载玻片表面,待测序的带有通用锚定接头的单个基因组DNA片段稀释后随机地被引物稀疏地固定在载玻片表面,随后用桥联PCR复制,在该DNA附近形成大约1000个完全一样拷贝的微小DNA簇(cluster)。最后测序时,采用Sanger测序类似的步骤,分别加入4种不同荧光标记的dNTP,芯片荧光扫描系统同时检测芯片中那些被固定的DNA簇的引物延伸过程,最终用软件分析得到整个基因组序列。

ABI的SOLiD(supportedoligoligationdetection)测序技术来源于Church课题组发明的连接测序(sequencingbyligation)方法[16],连接测序名称的原因是他们使用了DNA连接酶来进行测序。该法首先将断裂的DNA片段固定在微珠上,通过乳液PCR扩增后,将微珠以点阵的方式排布。加入测序引物与微珠上DNA片段的已知起始序列发生结合。随后加入长度为8个碱基的3′端起始的半简并引物,该半简并引物的第4位和第5位的碱基是确定的,根据碱基的不同组合,在末端标记不同的荧光素。当正确的半简并引物结合到待测DNA片段上时,连接酶识别接头处的4个碱基(起始端的两个在已知引物的5′端,终结端的两个在半简并引物的3′端)并连接起来,通过化学方法将第6位到第8位的碱基切除,释放出荧光团,通过测荧光确定序列的配对,亦即第4和第5位碱基序列。同时,连接酶启动下一轮的连接,上一轮的第4和第5位碱基将作为连接的起始端。由于每次连接切除后都是5的倍数,所以SOLiD测序的平均读长在25—35bp。由于每次读序为两个碱基,每个碱基被读两次,SOLiD测序仪具有很高的序列读取精确度和数据输出量。所有上述的高通量测序技术都还有待发展和完善,但高通量测序技术被Science评为2008年度十大最有影响力的科技发明之一,可以预见,在不久的将来,它们将替代现有的测序技术。

图6　454高通量DNA测序原理:(a)基因DNA被分离、断裂、连接到锚定接头上并变性为单链,(b)DNA单链被结合到微珠上,一个微珠连接一条DNA,微珠被分离和分配到含有上百万个小孔的平板上,加入PCR试剂反应后,每个微珠带有上千万条同一个DNA片段的拷贝,(c)将小孔内的DNA变性,微珠上携带的单链DNA模板被富集并转移到有光纤的微孔板上,(d)更小的携带固相焦磷酸测序酶的微珠被加入到每个微孔,(e)在加入微珠之前带有光纤探头的微孔平板的扫描电镜图片,(f)454测序仪含有的主要部件为:含有A、T、G、C脱氧核苷酸单体(dNTP)的溶液加入系统(i),包含光纤探头微孔平板的流动池(ii),CCD成像系统和计算机控制系统(iii)[15]

Fig.6　Principleofthe454highthroughputDNAsequencing.(a)GenomicDNAisisolated,fragmented,ligatedtoadaptersandseparatedintosinglestrands.(b)Fragmentsareboundtobeadsunderconditionsthatfavoronefragmentperbead,thebeadsareisolatedandcompartmentalizedinthedropletsofaPCR2reaction2mixture2in2oilemulsionandPCRamplificationoccurswithineachdroplet,resultinginbeadseachcarryingtenmillioncopiesofauniqueDNAtemplate.(c)Theemulsionisbroken,theDNAstrandsaredenatured,andbeadscarryingsingle2strandedDNAtemplatesareenriched(notshown)anddepositedintowellsofafiber2opticslide.(d)Smallerbeadscarryingimmobilizedenzymesrequiredforasolidphasepyrophosphatesequencingreactionaredepositedintoeachwell.(e)Scanningelectronmicrographofaportionofafiber2opticslide,showingfiber2opticcladdingandwellsbeforebeaddeposition.(f)The454sequencinginstrumentconsistsofthefollowingmajorsubsystems:afluidicassembly(objecti),aflowcellthatincludesthewell2containingfiber2opticslide(objectii),aCCDcamera2basedimagingassemblywithitsownfiber2opticbundleusedtoimagethefiber2opticslide(partofobjectiii),andacomputerthatprovidesthenecessaryuser

[15]

interfaceandinstrumentcontrol(partofobjectiii)

7　基于胶体光子晶体的微球高通量生物检测

　　阵列型生物芯片进行检测时,一个被检测的分

第11期肖守军等　生物芯片进展・2405・

子往往要穿越很多检测点后才能到达相应的探针分

子所在位置。这样即使是在使用少量的被检测液的情况下,扩散过程是一个耗时且必不可少的过程。因此,如何缩短目标分子到达探针分子的扩散时间是提高检测速度的关键。

提高目标分子和探针分子的反应速度可以通过将固定探针分子的载体变成与被检测液充分混合的流动载体得以实现(图7)。探针分子和被检测分子在溶液中的充分混合极大地减少了相互作用的时间。但是在使用流动载体时由于流动载体的空间不确定性,空间坐标不能被用来对探针分子进行编码,因此需要一个新的对探针分子进行识别编码的方法。

的粒径决定。和带隙频率相同的入射光会被光子晶体反射,从而在反射光谱上出现一个反射峰。光子晶体流动载体就是利用该反射峰的位置进行编码。在利用光子晶体编码载体进行多元检测时,首先用不同粒径的单分散球型粒子制备光子晶体微球,然后在不同的光子晶体微球上分别修饰不同种类的探针分子。由于光带隙的位置随组成光子晶体的纳米粒子的大小而变化,因此在任何一种光子晶体载体上固定的生物分子的种类都可以通过测定反射峰的位置来确定。在检测时,将分别修饰有不同探针分子(如一抗)的光子晶体编码微球与待测样品溶液混合,使探针分子与样品中的靶分子(如抗原)结合,然后洗去样品溶液,加入标记分子(如荧光标记二抗)再次结合靶分子(抗原)。这样靶分子(抗原)的有无可以通过检测标记分子的信号(如荧光、化学发光等)来确定,而靶分子(抗原)的种类,则可以通过与一抗偶联的光子晶体微球的编码(光子晶体反射峰位置)来确定。

图8　光子晶体微球的显微镜照片。(a)光子晶体微球;

图7　生物分子阵列(上图)和微球检测法(下图)示意图

Fig.7　Biomolecularsensingbymicroarraying(upper)andmicro2beadbio2coding(lower)

(b)微球在支撑表面排列的光子晶体纳米结构

Fig.8　Photoniccrystalmicro2beadsbyscanningelectronmicroscopy:(a)asinglebeadwasobservedand(b)aphotoniccrystalstructureonasupportingsurfacewasillustrated

现有的流动载体编码方法主要是光学编码如:

荧光染料分子编码、量子点编码、红外光谱自编码等。其中Luminex公司基于荧光编码微球的液相生物芯片已经取得了巨大的商业成功。因此,近几年以来,关于流动载体的编码一直是新型生物芯片的研究热点。

东南大学生物电子学国家重点实验室的顾忠泽课题组提出并实现了利用自组装胶体光子晶体微球

[17—19]

对生物分子进行编码的设想。该编码载体是由单分散的纳米粒子(粒子为球形,直径一般在几十纳米到几百纳米之间。粒径的分散度要求在5%以内)通过自组装形成的具有三维有序结构的纳米材料(图8)。粒子在自组装过程中形成密堆积纳米结构。光子晶体中的球形粒子的周期排列会形成光带隙结构。光带隙的频率由构成光子晶体的纳米微球

图8中的光子晶体微球由直径为260nm的纳米粒子组成。可以看出光子晶体微球表面与其他微球不同,具有有序的纳米周期结构。这种周期结构增大了微球的表面积,从而增加了球表面探针分子的固定量。用作编码的反射峰来自于光子晶体微球的纳米结构,通过改变组成光子晶体的纳米微球的大小可以非常简单地对光子晶体微球的编码信息进行设计。与荧光染料编码相比,这种来自于纳米结构的编码具有无与伦比的稳定性,不会产生任何荧光漂白和荧光猝灭现象。

图9是3种不同编码的光子晶体球及其在免疫

[20]

分析中的应用。由于光子晶体微球不含有染料和量子点等发光物质,因而荧光本底很低。这种编码方法有效解决了Luminex的xMAP技术平台中的

・2406・

化　学　进　展

第21卷

荧光编码稳定性差、荧光背景高和荧光干扰等诸多

问题,而且可以利用光子晶体的反结构对生物分子进行非标记传感,同时具有制备成本低、检测灵敏度高、检测所需设备简单等优点,在流行病检测、癌症、心血管疾病早期诊断等需要快速、高灵敏度、多元检测的领域具有广泛的应用前景。

酸容易流失,也导致测量误差增大;(2)探针分子的

表面覆盖度及其均匀性还没有很好地解决,这也是导致被捕获的目标分子的量不确定性的重要原因之一,从而读出荧光强度也就有很大误差;(3)固定在表面的探针分子的结构不均匀性,如果探针分子是一个蛋白质分子的话,该蛋白质固定位点的不同(如不同位点的自由氨基的固定)将带来蛋白质分子的结构在表面上取向和生物活性的不同,从而导致对捕获的目标分子的量和结构的不确定性;(4)各个操作环节对芯片的污染;(5)需要前期直接或间接的荧光标记过程。上述原因导致的读出的荧光强度的误差是目前生物芯片应用的最大拦路虎,这导致了实验数据的不重复性,特别是临床检验等应用领域对生物芯片数据可靠性的质疑。上述的局限推动了三维生物芯片的研发。8.1　三维胶垫式阵列芯片图9　利用光子晶体编码微球的多元检测。红色,绿色和蓝色光子晶体微球分别由250nm,220nm和200nm单分散PMMA纳米粒子自组装得到。在红绿蓝三种光子晶体微球的表面分别包被有人IgG,兔IgG和小鼠IgG,并封闭了未包被蛋白的空位点。将这三种颜色的微球与含有FITC标记羊抗人IgG和羊抗兔IgG的样品溶液共同温育,反应结束后进行充分洗涤。在检测时,利用装有光纤光谱仪的荧光显微镜先后检测微球反射光谱(编码)和微球表面的荧光(标记信号),并将荧光标记信号和编码信号对应起来[20]

Fig.9　Multipleximmunoassaybasedoncolloidalcrystalbeads.Threekindsofantigenswereimmobilizedonthreekindsofencodedcolloidalcrystalbeads.Threeencodedbeadswithred,green,andbluecolors(right)wereimmobilizedwithhumanIgG,rabbitIgG,andmouseIgGrespectively,andexposedtoasamplesolutioncontainingFITC2taggedgoatanti2humanIgGandgoatantirabbitIgG.Thefluorescencewasdetectedonredandgreenbeadsbutnotonbluebeadsthroughthefluorescencespectraorfluorescencemicroscopicimages(left)respectively.Thebeadcodeswereidentifiedbyeithertheopticalreflectionspectraorcolorimages

[20]

科学家们在载体表面构建了多种三维胶垫式阵列(3Dgel2padmicroarray)芯片,三维胶垫主要有凝胶、纳米纤维和微球等。其制作方法为在载片(玻片或尼龙片)表面用自动点样器布上高分子单体(如丙烯酰胺)配方的阵列,等点阵上的单体聚合一段时间后就会凝胶化,将凝胶用化学方法活化,使之带有活性交联基团,再将蛋白质或DNA探针溶液用自动点样机械手臂加入凝胶阵列上并被固定。微电子工业的光刻技术也能应用在制备三维胶垫式阵列芯片上,无论正胶或负胶(负胶应用得较多),显影后留存在载片上的三维胶垫式阵列就可以被活化和用于固定生物分子。由于凝胶衬垫点阵的三维结构提供了一个稳定的支持作用和湿润的环境,它能够结合更多的探针分子并使之保持在类似于天然的水溶液状态中,这样的三维胶垫式阵列芯片显著增强了检测的敏感性,可达到快速高效的检测分析目的。目前发现水凝胶载体不仅有很强的蛋白质结合力,而且背景也低,可用于检测不同的样品源,如细胞组织溶

[21—23]

解物和体液等。8.2　多孔硅载体的三维生物芯片除了高分子的三维胶垫芯片外,将载片三维化也是研发的一个方向,多孔硅膜就可能是这样的一类载片。多孔硅是一类含有纳米孔或骨架的海绵状功能材料(图10),具有比表面积大可用于多载生物分子、半导体的导电性质可用于激光解析光谱、反应活性高用于偶联生物分子和透红外用于红外检测等特征。电化学蚀刻法是最常用的制备多孔硅的方法,形成的多孔硅具有孔径大小可调(最小可达几个

8　三维阵列芯片

　　目前使用广泛的平铺探针点阵是建立在低荧光背景的玻璃片和高分子膜如尼龙和赛璐珞膜上。但荧光信号的上述微阵列芯片有如下几点缺陷:(1)由于平铺的探针点阵能固定的探针分子的量很少,使得测量误差增大;虽然利用高分子涂层如聚赖氨酸能提高固定的探针分子的量,但物理吸附的聚赖氨

第11期肖守军等　生物芯片进展・2407・

纳米,最大可达几十微米)、孔分布较规则、多孔层深

度较大且可根据需要控制方便的优点,并且形成的多硅层表面的粗糙度和晶格结构基本上仍保持和衬底一样。

后荧光背景低、红外透光等物理特征,很适合作为三维微阵列芯片的载体;(3)通过化学修饰后制备的蛋白质微阵列可以用荧光扫描和MALDI(基质辅助激光解吸)质谱作为芯片的读出信号,用红外光谱、反射干涉谱、XPS、AFM和SEM等作为辅助分析手段,从而实现蛋白质微阵列的多种检测模式功能,以期对点阵点的结果去伪存真,达到交叉验证和提高蛋白质微阵列分析结果准确性的目的;并且可以节省大量制备和获取目标分子样品的时间、劳动、资源和经费;(4)阵列的制备方法既可用机械自动点样的方法,也可用成熟的微电子的光刻方法。光刻法是一种质量更高的图案化方法,精度高,可达微米数量级,而且与直接点样相比,减小了微阵列点之间的个体差异,图案规则整齐,不同阵列间的平行性比较高,保证了微阵列质量的高精度;(5)多孔硅表面的活性Si—H基团可利用来制备探针单分子膜、高分子刷或水凝胶垫膜,不但具有三维胶垫芯片的特点,还从多角度具有不可替代的优越性。如共价偶联的软物质膜的稳定性和多种测量的交叉验证使得整体生物芯片测量的结果更准确,对一些要求准确测量的样品其效率更高、花费更少。

多孔硅上固定蛋白质的示意图见图11。一个端基为烯烃、重氮、叠氮、卤素或炔烃基团的有机分子可与多孔硅的Si—H反应,另一个端基官能团为羧酸和羟基等的有机和高分子可用来固定探针分子,如CH2CH—Xn—Y(其中X=CH2;n的最佳范围为5—20;Y=OH,COOH,Br或其它官能团)。我们利用金属螯合的有机分子膜———次氨基三乙酸(NTA)2NiⅡ与组氨酸标记(6×Histag)的蛋白质的配位固定构建了微阵列芯片,应用了多种检测模式(荧光、MALDI质谱和红外光谱等),取得了很好的模型实验结果。

图10　多孔硅的扫描电镜图。上图为俯瞰图,下图为剖面图。电化学蚀刻具有各向异性,孔洞从表面延伸到内部[25]

Fig.10　Topographies(upper)andcross2sections(lower)of

[25]

poroussiliconbyscanningelectronmicroscopy(SEM)

最先利用多孔硅作蛋白质生物芯片载片的实验由瑞典LUNDUniversity的Laurell教授领导的小组报道

[24—27]

,不过,他们利用的是多孔硅膜对蛋白质的

物理吸附,该方法的缺陷也很明显,蛋白质的固定不牢固,洗涤和蛋白质的选择要非常小心。大连化物所的邹汉法小组在利用多孔硅作为生物芯片的载片并用质谱技术检测领域做出了许多优秀的工作上应用多种模式的检测方式

[29—33]

[28]

。

作者所在研究小组的一个想法是在同一块芯片

,如多孔硅芯片可

用透射红外光谱、激光解析质谱、反射干涉谱和荧光扫描的方法来交叉验证,这样就免除了通过传统的生物化学技术来验证的繁琐过程,以硅作载片的生

2

物芯片虽然载片价格略贵(011—1元Πcm),玻片和高分子膜则只有011—1分Πcm,但相对于昂贵的生物样品来说,硅载片的价格可以忽略不计。我们采用多孔硅作载片主要基于以下考虑:(1)硅片符合平面基质载体的要求,硅材料本身不发射荧光,具有很低的荧光背景;(2)硅片可以经腐蚀形成多孔硅膜,多孔硅膜具有比表面积大、反应活性高、经溶液处理

2

图11　多孔硅表面固定生物分子的卡通图,X为C、O或

N,Y为交联基团,Z为蛋白质的活性基团

Fig.11　Cartoonforimmobilizationofbiomoleculesonporoussilicon

作为一个例子来介绍,我们使用了多孔硅点阵

诱导的水凝胶垫来固定蛋白质(图12,13),既具备了三维芯片的优点,硅基片还兼有多重检测模式的

・2408・

化　学　进　展

第21卷

图12　在硅片表面形成蛋白质微阵列过程示意图。整个实验过程可归纳为6步:(1)经涂胶、前烘、曝光、显影和坚膜形成

2+

一层图案化的光刻胶膜;(2)将新鲜腐蚀的多孔硅微阵列放入Cu+ΠCuΠTEMED和PEGMA的聚合溶液中,通过原子转移自

由基聚合(ATRP)在PSi阵列上形成水凝胶膜点阵(a);(3)将水凝胶膜上大量的羟基与丁二酸酐反应转换成羧基(b);(4)羧基在DCC(二环己基碳二亚胺)的作用下与NHS(N2羟基琥珀酰亚胺)发生反应生成NHS酯(c);(5)将c放入氨基NTA

(ANTA)的碱性溶液反应生成NTA的表面(d),NTA与金属离子Ni2+发生螯合作用(e);(6)将连接了Ni2+2NTA的多孔硅浸入

到His2tagthioredoxin2urodilatin的蛋白质溶液中,蛋白末端所含的多个组氨酸残基取代两个水分子与Ni2+配位,从而在多孔硅表面上固定蛋白质形成生物芯片(f)[28]

Fig.12　Schematicprocedureofmicroarraypreparation.Microarraysaredefinedasfollows:PSi(p),polyPEGMAgel2pad(a),carboxyl

2+[28]pendant(b),NHS2functionalized(c),NTA2functionalized(d),Ni2loaded(e),andHis2taggedprotein(f)microarrays

优势。我们将水凝胶转化为金属螯合的Ni2NTA点阵,它们可以捕获N端或C端标记了一段含多个(5个或6个以上)连续的组氨酸(His)残基的蛋白质(His2taggedproteins)。其原理主要是基于被检测物

Ⅱ

近两年来,IMAC的概念已被借鉴用于在金属表面选择性固定蛋白质。

我们还在多孔硅有机单分子膜的基础上,发展了聚合物刷技术。聚合物刷(polymerbrush)是指在特定的基质表面或界面上固定具有很高密度和一定长度的聚合物分子链而形成的一种特殊高分子结构。聚合物刷相当于在特定的基质表面或界面形成了一层薄薄的涂层,可以有效地改善某些材料的表面化学和物理性能。相比有机单分子膜而言,其优点有:(1)聚合物刷更厚,能有效地阻止溶液对多孔硅膜的侵蚀,更好地保护和稳定多孔硅膜;(2)在同一个聚合物链上携带有几十至上百个交联基团,可以高密度地固定探针分子,这样降低了检测的难度,提高了检测的准确性。通过缩短反应步骤,也可提高表面覆盖率。

与通过螯合配体固定在基质材料上的金属阳离子之

Ⅱ

间作用力的不同。例如,Ni2NTA就是基于配位固定方法中最为普遍使用的系统之一,配体NTA(氨基三乙酸)通过自身4个配位点连接镍离子,剩下两个空位可与标记蛋白的组氨酸单元所含咪唑基团发生配位作用。这种基于IMAC的固定方法具有以下几个显著优点:(1)选择性固定蛋白的效率高、容量大,非特异性吸附少;(2)蛋白质的生物活性基本能保持,稳定性通常也得到提高;(3)这种空间上定义的连接方式使得蛋白质取向可控;(4)标记的组氨酸与2+

Ni的配位是快速且可逆的反应;(5)作为商品而言,有大量各种标记了组氨酸的蛋白质可供选择。

第11期肖守军等　生物芯片进展・2409・

等不良影响,使微量的生化反应能干净顺利地进行。

透明的硅橡胶生物芯片使生化反应能被光学仪器在线检测,以硅橡胶为材质的微流控生物芯片最近十多年来得到了长足的进步。

10　生物芯片展望

　　虽然生物芯片在技术上还存在一些有待解决的问题,但它的发展前景是不可限量的。目前较欠缺

图13　图12的物理和化学反应过程中的典型显微镜照片。左上图:单个多孔硅点阵结构的俯视和剖面图;右上图:多孔硅结构上Si—H诱发的水凝胶膜;左下图:多孔硅点阵结构的红色荧光微阵列;右下图:水凝胶点阵结构捕获FITC标记的蛋白质后的绿色荧光微阵列

[28]

的是生物芯片的应用问题,在实际应用中,人们还是对它的数据和结果存在疑虑,当然应用问题也涉及到生物学的基础研究———物质和它的功能的关系。但也有一些成功的例子,比如在蛋白质芯片的应用方面,Zhu和Snyder等

[36]

克隆了5800个酵母的开放

Fig.13　TypicalmicrographiesofFig.12duringthephysicalandchemicalfabricationprocedure.Upperleft,topographicandcross2sectionimageofaporoussilicondotbySEM;upperright,gel2padmembraneafterATRPpolymerizationwithanopticalmicroscopy;bottomleft,redfluorescencemicroarraysofnativeporoussilicon;proteins

[28]

阅读框,表达并纯化了相应的蛋白质,并将这些蛋白质固定在芯片上做成酵母的蛋白质组芯片,用来筛选与这些蛋白质作用的其它蛋白质和磷脂的活性。他们鉴定出许多新的可与钙调蛋白和磷脂相互作用蛋白;还发现许多钙调蛋白结合蛋白时可能共同拥有的一个结合基元。这样就能制成一个完整真核蛋白质组芯片来筛选各种生化活性,还可应用它来筛选蛋白药物相互作用和检测翻译后蛋白质的修饰。这是目前为止第一个生物的全蛋白质组芯片。生物芯片各个方面的发展都在朝建立一个高度整合的芯片实验室“LabChip”迈进。

致谢:感谢东南大学生物医学工程系的顾忠泽教授和赵祥伟博士提供第7章节里的图片和素材。该工作得到江苏省青蓝工程基金和东南大学生物电子学国家重点实验室开放基金资助。

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bottomright,greenfluorescenceFITC2labeledHis2tagged

microarraysafterattachmentof9　微流控生物芯片

　　生物芯片技术的目的是将样品的制备、生化反应到检测的整个分析过程集成化为全微分析系统

(μTAS),亦即芯片实验室(lab2on2a2chip)。目前,集成有加热器、微泵微阀、混合器、微流量控制器、光探测器的全微分析原型系统已经研制出来。其中较有影响力的一项研究是Quake教授的课题组于2000年提出的以高分子硅橡胶材料为物质基础研究纳升量级的微流控生化反应生物芯片

[33—35]

。由于该技

术相对于其他生物芯片易于加工和用气体控制阀和泵的特点,在出现之初获得了科学界和工业界的格外青睐,2000年底投资建立了FluidigmCorporation。硅橡胶(PDMS)微流控生物芯片的技术为:根据需要设计微流控反应器线路,利用喷绘技术将线路绘在塑胶片或利用微电子工艺的布线技术将图案布在硅片上,硅橡胶从液态到橡胶的硫化过程将线路图案转移到硅橡胶芯片上,硅橡胶层间以及与基底间的键合构成微流控生物芯片,该技术的多层布控使得芯片高度集成化,上千个微米量级的管道、开关和数百个纳升量级的微反应器能被集成在1cm的芯片上,使用气压和液压的开关和流体输送技术降低了电驱动的LabChip的液体扩散、发热、气泡和副反应

2

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