（精编）神经生物学的形态学研究方法

(精编)神经⽣物学的形态学研究⽅法第⼀部分神经⽣物学的形态学研究⽅法⼀、研究神经细胞的形态及细胞构筑的⽅法（⼀）尼⽒（Nissl）染⾊法原理⽤碱性染料染神经组织常⽤染料焦油紫、硫堇、中性红结果尼⽒⼩体被染⾊，背景⽆⾊。

⽤途⽪质的分层、分区、脊髓灰质的分层、核团的分区、细胞的构筑（⼆）⾼尔基（Golgi）镀银染⾊法原理铬银与脂蛋⽩形成复合物，在细胞膜系统的间隙内形成结晶结果整个细胞为⿊⾊⽤途显⽰整个细胞的全貌⼆、研究神经径路的⽅法（⼀）溃变法

原理神经元胞体或纤维损伤后远侧部分发⽣顺⾏变性（纤维交替膨胀和狭窄，呈念珠状继⽽呈颗粒状），可⽤镀银法显⽰或电镜观察。胞体发⽣逆⾏变性（胞体内⾊质溶解，胞体肿胀，核偏向胞体的⼀边），可⽤尼⽒法显⽰。应⽤研究纤维联系。

（⼆）辣根过氧化物酶（HRP）标记法

原理HRP注⼊神经组织或脏器—逆⾏、顺⾏、过节标记—H2O2、⾊原酶反应—呈⾊试剂HRP：1.游离HRP

2.结合HRP(WGA-HRP、CT-HRP）⾊原：1.⼆氨基联苯胺(DAB)2.⼆盐酸联苯胺(BDHC)3.邻-联茴⾹胺(OD)4.四甲基联苯胺(TMB)稳定剂:硝普钠、钨酸钠

⽤途研究脏器的神经⽀配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。（三）荧光素轴突逆⾏传递标记法

原理将荧光物质注射⾄神经元的轴突分布区,经分⽀的末梢吸收后，循轴突逆⾏输送⾄胞体。在荧光显微镜下可看到胞体内呈现荧光标记物。

荧光素FurogoldFB-NYGB-NYTB-BbPI-BbEB-DAPA应⽤研究神经元的轴突分⽀⾄不同部位的投射。（四）放射⾃显影⽰踪技术

原理将放射性同位素3H等标记的氨基酸导⼊神经组织，氨基酸被神经元摄取后在胞体内合成蛋⽩质，沿轴突顺⾏运输，分布于

整轴突和末梢，同位素产⽣的核射线使照相乳胶感光，根据感光银粒所在部位和⿊度判断放射性⽰踪剂的位置和数量，从⽽确定神经纤维的路径。

⽰踪剂3H-脯氨酸标记终末、跨突触标记3H-亮氨酸标记终末、纤维3H-HRP酶蛋⽩与HRP结合双标记⽤途研究神经元的传出路径（五）2-脱氧葡萄糖放射⾃显影法

原理2-DG能与葡萄糖竞争和6-磷酸葡萄糖异构酶结合，但不能转化为相应的磷酸果糖，因此滞留在细胞中。将2-DG标记上放射性同位素，就可追踪中枢神经系统中各种神经结构的代谢率。

结果在感光底⽚上，代谢率较⾼的核团和区域银粒较密。⽤途显⽰处于兴奋状态的神经元链。（六）植物凝集素标记法

原理凝集素通过神经细胞膜上不同受体的介导⽽被胞饮⼊神经元内，经轴突运输⾄⼀定部位，再⽤免疫组化的⽅法显⽰。凝集素麦芽凝集素（WGA）可与HRP、荧光素结合菜⾖凝集素（PHA-L）

⽤途顺⾏或逆⾏追踪，研究神经通路。（七）葡聚糖胺结合⽣物素

原理葡聚糖胺结合⽣物素(BDA)被胞饮⼊神经元内，经轴突运输⾄⼀定部位，再⽤组化反应或荧光显微镜显⽰。⽤途顺⾏追踪，研究神经通路。（⼋）病毒标记法

原理活病毒导⼊神经元，增殖，顺次进⼊各级神经元，⽤免疫组织化学显⽰。病毒疱疹病毒（单纯疱疹病毒Ⅰ型、猪疱疹病毒）弹状病毒

⽤途跨突触标记（顺向或逆向）

近年来，⽤分⼦⽣物学⽅法制作基因重组病毒。将绿⾊荧光蛋⽩（GFP）的基因整合⼊病毒，通过病毒增值，GFP在感染的神经元中表达。在荧光显微镜下观察GFP基因重组病毒在单个神经元范围内顺⾏或逆⾏标记，可显⽰神经元全貌，与Golgi法相似。

三、研究神经肽分布的⽅法（⼀）黄递酶组织化学

原理尼克酰胺腺嘌呤⼆核苷酸磷酸-黄递酶（NADPH-d）是神经型⼀氧化氮合成酶(nNOS)的辅酶，两者⾼度共存。可将底物B-NADPH氧化成B-NADP，释放H2，使显⾊试剂硝基四氮唑蓝(NBT）还原成DBT,黄⾊变成蓝⾊或紫蓝⾊。⽤途研究周围及中枢神经系统nNOS神经元。（⼆）诱发荧光组织化学法

原理神经元内含量很微的单胺类物质如多巴胺（DB）、去甲肾上腺素（NA）、肾上腺素（A）和5-羟⾊胺（5-HT）与某些醛类

物质在⼀定条件下发⽣聚合反应，形成新的环形化合物，在荧光显微镜下发出较强的不同颜⾊的荧光。醛类⼄醛酸、多聚甲醛加戊⼆醛等

⽤途研究周围及中枢神经系统单胺类神经元。（⼆）免疫细胞化学⽅法

原理⽤特异抗体加在神经组织切⽚上孵育，形成抗原-抗体复合物，将之⽤可见物质（荧光素、HRP、同位素等）标记出来，在镜下观察。分类直接法间接法

直接法标记抗体——抗原——显微镜观察

特点：简单、省时、特异性⾼、⾮特异性染⾊轻。敏感性差，⼀种标记抗体只能检测⼀种抗原。现少⽤。间接法标记抗抗体抗体抗原显微镜观察

特点：只要标记⼀种抗体就可检测多种抗体。敏感性⾼，⽤途较⼴。⽬前多⽤。

⾮标记抗体过氧化物酶-抗过氧化物酶法（抗酶抗体、PAP法）原理酶抗体（兔）——⼆抗（⽺）——⼀抗（兔）——抗原

ABC法）

⽣物素与抗体ABC复合物——⽣物素化⼆抗（⽺）——⼀抗（兔）——抗原⼀抗

ABC 复合物：HRP-⽣物素-卵⽩素

免疫荧光标记

原理通过⽣物素将荧光标记物直接与2抗结合。抗原——⼀抗

（⽺）

免疫胶体⾦技术

胶体⾦（⾦的⽔溶液）能稳定⽽迅速地吸附蛋⽩，⽽蛋⽩的⽣物活性没有明显改变。免疫⾦探针（胶体⾦+

免疫球蛋⽩）进⾏细胞表⾯和细胞内多糖、糖蛋⽩、蛋⽩质、抗原及激素等⼤分⼦的精确定位。主要以电镜观察。待测抗原⼈⼩⿏抗⼈

免疫细胞化学技术⼩结

放射免疫组织化学⽤同位素标记抗体免疫荧光组织化学⽤荧光素标记抗体免疫酶组织化学⽤酶标记抗体免疫胶体⾦组织化学⽤⾦标记抗体

⾮标记免疫酶组化（PAP法）⽤免疫⽅法制备酶抗体亲和免疫细胞化学（ABC法）酶标⽣物素与卵⽩素结合⽣物素化抗体

四、电⼦显微镜技术（透射电镜）

应⽤：⽤于研究神经组织的超微结构。具体应⽤于：研究正常神经组织的超微结构研究神经组织的发育、衰⽼变化研究神经纤维联系与HRP、溃变等结合研究神经肽的分布与免疫组化结合多项研究的结合

五、原位分⼦杂交组织化学技术

核酸分⼦杂交技术：在碱性环境下，加热或加⼊变性剂，使双链DNA 分⼦解链成两条单链（或单链RNA），加⼊已知的标记RNA或DNA 序列⽚断（探针），在⼀定条件下，则DNA与相应的互补DNA或RNA、RNA与相应的RNA重新形成稳定的异质双链分⼦（DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA、RNA-DNA）。上述形成异质双链的过程称分⼦杂交。核酸分⼦杂交依据杂交条件不同分三种类型：液相杂交、固相杂交、原位杂交

原位分⼦杂交组织化学：

核酸分⼦杂交技术与组织细胞化学及免疫组织化学技术结合起来，在组织细胞原位显⽰某种特定基因、mRNA及其产物（特异蛋⽩）的表达、定位、半定量及其变化规律的技术。应⽤显⽰脑内各种mRNA的分布特点。观察发育过程中基因表达的发⽣、发展规律。研究基因表达的影响因素及其调节机制。研究⼈类神经系统疾病。脑内特定的mRNA的半定量观察。与其它形态学⽅法结合应⽤。

免疫组织化学与原位杂交组织化学技术的⽐较IHCISHH

原理抗原抗体反应碱基互补

显⽰结构特定的抗原特定的mRNA、基因（mRNA编码的蛋⽩质）（特定的基因部位）显⽰部位最终产物的部位蛋⽩质合成的部位（胞体及突起、终末）（胞体）六、其它新技术（略）第⼆部分边缘系统

在神经系统发⽣过程中，由古⽪层和旧⽪层演变⽽来的哺乳动物⼤脑的古⽼结构被称为边缘系统。许多学者认为它还应包括神经系统中与这些结构有密切关系的区域，故边缘系统所包含的神经部位相当⼴泛。已有研究⼯作证明边缘系统和呼吸、循环、内分泌、摄⾷饮⽔、体温调节和性⾏为等⽣理功能有关；另⼀⽅⾯，这个系统和许多⾼级机能活动，如学习、记忆、睡眠和情绪活动有着密切的关系。所以边缘系统越来越为研究⼯作者所注意。边缘系统包括边缘叶和⽪质下结构。⼀、前脑边缘叶（⽪质部分）

前脑边缘叶limbiclobe即边缘系统的⽪质部，位于半球内⾯邻近脑⼲处，由内外两圈组成。内、外圈以胼胝体沟、海马沟为界。此外，脑岛前部、眶回后内侧部等也列⼊边缘叶的范围。外圈：扣带回、扣带回峡、海马旁回及钩，合称穹窿回。内圈：海马结构和梨状叶的近中线部分。（⼀）海马结构

1．胼胝体下回subcallosalgyrus即终板旁回，位于终板和后旁嗅沟之间，向上连灰被，向下连斜带回和内侧嗅纹。

2．灰被indusiumgriseum即胼胝体上回，是被盖于胼胝体背⾯的⼀薄层灰质，向外移⾏于扣带回⽪质。灰被背⾯有内侧纵纹和外侧纵纹。灰被向后延续为束状回。3．海马和齿状回

海马hippocampus⼜称安蒙⽒⾓cornuammonis，位于侧脑室下⾓底部，表⾯有室管膜，膜的深⾯⼀层⽩质为室床，其纤维向后聚集形成海马伞。齿状回dentategyrus为狭长的⽪质带，位于海马的内侧，除内侧⾯外均为海马包绕，其内侧⾯位于海马沟和海马伞之间。4．下托subiculum是海马旁回⽪质和海马⽪质的过渡区。根据细胞构筑，下托可分为四条带：下托尖（副下托）、下托、前下托和旁下托。⼀般把前⼆者归⼊海马，后⼆者归⼊内嗅区。（⼆）梨状叶

梨状叶piriformarea包括外侧嗅回、钩（部分）、海马旁回前部。梨状叶可分三区：

前梨状区——为外侧嗅回及环周回（岛阈）梨状区（杏仁周区或半⽉回）——位于钩的背⾯内嗅区——海马旁回的前部（三）其它

扣带回、海马旁回后部、眶回后部和脑岛前部等区域的⽪质层结构是同源⽪质（新⽪质）和异源⽪质（古、旧⽪质）之间的过渡型，其颗粒细胞较同源⽪质少，属中间⽪质。其组织结构、纤维联系和功能等均与边缘叶密切相关，故也列⼊该部。⼆、⽪质下结构（⼀）杏仁核簇

杏仁核簇或杏仁复合体amygdaloidcomplex位于侧脑下⾓的前内侧和前背侧，钩的深部。其背侧为⾖状核、前背侧为前穿质、尾侧连尾状核、外侧连屏状核。

杏仁核簇分为两群：⽪质内侧核群⼈类较⼩，为杏仁核簇的背内侧部，位于半⽉回的深侧，包括：⽪质杏仁核、内侧杏仁核、杏仁核、外侧嗅束核、杏仁前区。

基底外侧核群⼈类较发达，包括：外侧杏仁核、基底杏仁核和副基底杏仁核（⼆）隔区和隔核

隔区septalarea和隔核隔区包括胼胝体下区（旁嗅区）和终板旁回的⽪质部，形成侧脑室前⾓的内侧壁。隔核为隔（三）间脑中相关核下丘脑（包括视前区）上丘脑（包括缰核和髓纹）丘脑前核（四）边缘中脑区

边缘中脑区位于中脑被盖的内侧部，包括：Tsai腹侧被盖区、脚间核、中脑灰质腹侧部、中缝背核、被盖上核、背侧被盖核和腹侧被盖核。三、边缘系的纤维联系（⼀）边缘系的主要通路（⼆）边缘系⽪质间的联系

1．扣带联系边缘叶的各部，并将边缘叶与周围新⽪质联系起来。2．钩束联系眶回和颞叶前部。3．前连合联系两侧颞叶前部。4．海马连合联系两侧海马。（三）海马的纤维联系1．海马的传⼊纤维联系

内嗅区—穿通纤维—海马、齿状回内侧隔核、斜带核—穹隆—海马、下托胼胝体上回—纵纹—束状回—海马伞—海马边缘中脑区—海马2．海马的传出纤维联系丘脑前核板内核背内侧核缰核海马—穹隆（连合后）——乳头体

（连合前）——隔外侧核视前外侧区下丘脑前核斜带回束状回灰被扣带回内嗅区下托

下托——内嗅区颞叶的邻近部扣带回内侧额叶的后部杏仁核簇（四）杏仁核簇的纤维联系1．杏仁核簇的传⼊纤维联系

嗅球、嗅前核—⽪质内侧核群、外侧嗅束核前梨状⽪质—基底外侧核

外侧视前区—终纹、腹侧杏仁传出束—杏仁体下丘脑腹内侧核—杏仁体

中缝背核、蓝斑、臂旁核、⿊质、孤束核—杏仁核颞叶前部、眶额⽪质、扣带回、脑岛前部、运动⽪质—杏仁体2．杏仁核簇的传出纤维联系

杏仁核簇—终纹—终纹床核、下丘脑（前核、腹内侧核、内侧视前区）、隔核

基底外侧杏仁核—丘脑腹侧传出—外侧视前区、下丘脑外侧区、隔区、斜带核

杏仁核—下丘脑外侧区、⿊质、中脑灰质、⽹状结构、臂旁核、迷⾛神经背核簇基底外侧杏仁核—杏仁纹体纤维—纹状体杏仁核簇—前额⽪质（五）其它纤维联系1．内侧前脑束

内侧前脑束medialforebrainbundle(MFB)⾃隔区经下丘脑外侧区⾄中脑被盖区，束中的散在细胞为内侧前脑束床核。MFB中上⾏纤维：脑桥上部—下丘脑腹内侧核背侧被盖核—视前区—隔

腹侧被盖区、下丘脑前区、外侧视前区—隔

脑⼲核—前脑结构（多巴胺能、去甲肾上腺素能、5-HT能纤维）MFB中下⾏纤维：眶额⽪质隔—外侧视前区

斜带核—下丘脑外侧区、腹侧被盖区、乳头体隔—视前区、腹侧被盖区、上核下丘脑—蓝斑核

内侧视前核—下丘脑多数核、边缘中脑区、中脑⽹状结构

下丘脑前区—背内侧核、腹内侧核、漏⽃核、腹侧被盖区、中缝背核、灰质、中脑⽹状结构下丘脑腹内侧核—中脑灰质、腹侧被盖区、蓝斑2．乳头被盖束2．背侧纵束

背侧纵束由上下⾏纤维组成，从下丘脑后部⾄延髓，全长均在脑室旁。背侧纵束内纤维有：孤束核—背侧被盖核

背侧被盖核灰质—下丘脑后部

孤束核—下丘脑背内侧核室旁核终纹床核丘脑室周核下丘脑室旁核后核—脑⼲脊髓植物性中枢下丘脑内侧区—灰质背侧被盖核

背侧被盖核—三叉神经运动核、⾯神经核、疑核、上涎核、下涎核、迷⾛神经背核簇、⾆下神经核3．髓纹、缰核脚间束髓纹缰核脚间束

隔内侧部斜⾓带核—髓纹—内侧缰核—脚间核—背侧被盖核

外侧视前区苍⽩球内侧部—髓纹—外侧缰核—缰核脚间束—脚间核—⿊质致密部、灰质、中缝背核、上核、⽹状结构海马杏仁体丘脑前核—髓纹—缰核四、边缘系统主要功能

感觉影响中枢听觉、影响中枢其它感觉。边缘系统是控制外界“多余”信息进⼊意识领域的⼀个重要结构。

情绪反应杏仁体和下丘脑与情绪反应有较密的关系。摄⾷杏仁体、隔区参与对饱中枢和摄⾷中枢活动的调节。记忆海马环路与记忆活动有关。

其它植物性反应边缘系统参与⼼⾎管、呼吸、消化、⽣殖等植物性活动的调节。第三部分脑⼲⽹状结构⼀、概述

脑⼲⽹状结构reticularformation是指位于脑⼲深部的境界不清的神经细胞群和联系形式弥散的纤维相互交织的区域。⽹状结构接受来⾃⼏乎所有感觉系统的信息，其传出联系则直接或间接⾄中枢神经系统各个部位。⽹状结构的功能是多⽅⾯的，它涉及觉醒睡眠的周期、脑和脊髓的运动控制以及各种内脏活动的调节等等。根据脑⼲⽹状结构的细胞构筑和功能，可将其分为三个纵⾏区：正中区（旁正中区）由中缝核组成内侧区内侧2/3外侧区外侧1/3⼆、⽹状结构的构造（⼀）⽹状结构的核团1．正中区

（1）中缝隐核延髓中部⾄脑桥下部的被盖背侧，中缝两旁的纤维⽹内，主要由⼩型神经元组成。（2）中缝苍⽩核隐核的腹侧、锥体背侧中线上，不成对，主要由中、⼤型神经元组成。

（3）中缝⼤核延髓橄榄上部⾄脑桥中下部的被盖腹侧中缝两侧，其腹侧邻近斜⽅体。主要由⼤、中型神经元组成。（4）中缝脑桥核（下核）位于脑桥被盖，内侧丘系与顶盖脊髓束之间的中缝两侧，由中、⼩神经元组成。

（5）上核脑桥中份⾄中脑下端中缝两侧的⼀⼤群密集的⼩、中型细胞，为下核的上延，嘴侧端的腹侧邻近脚间核。2．内侧区

（1）延髓核（内侧份）⼜称腹侧⽹状核位于延髓下部，下橄榄核背侧（S）。

（2）巨细胞⽹状核下橄榄核嘴侧半的背内侧（L、M、S）。

（3）桥尾侧⽹状核脑桥下部，尾侧续于巨细胞⽹状核，嘴侧达三叉神经运动核平⾯（S、L）。（4）脑桥被盖⽹状核似脑桥核向被盖的延伸，内侧丘系的背内侧（多极）。

（5）桥嘴侧⽹状核脑桥上部，桥尾侧⽹状核的延续，嘴侧伸⼊中脑尾侧部（L）。

（6）楔形核、底楔形核中脑顶盖的腹内侧，被盖束的外侧（M、S）。此两核与脚桥被盖核合称中脑深被盖核。除上述说不诸核外，有⼈把蓝斑核、蓝斑下核、中脑背侧被盖核和腹侧被盖核以及中脑⽔管周围灰质也归于内侧区。3．外侧区位于背外侧，⼏乎全部由⼩细胞组成，有⼈称其为⽹状结构的⼩细胞部或⼩细胞⽹状核。细胞轴突较短，向内侧终⽌于⽹状结构的内侧区，⼀般认为是感受和联络区，此核延伸脑⼲全长。（1）延髓部延髓核的外侧部，三叉神经脊束核的内侧，前庭神经核的腹侧。

（2）脑桥部包围⾯神经核和三叉神经运动核。

（3）中脑部分三群：外侧臂旁核、内侧臂旁核和脚桥被盖⽹状核。（⼆）⽹状结构的纤维联系1．传⼊纤维联系

（1）脊髓⽹状纤维起于脊髓灰质中间带，交叉后于前外侧索中上⾏，直接或间接终⽌于⽹状结构内侧区，脊髓⼩脑束、脊髓丘脑束和内侧丘系的侧⽀可终于⽹状结构外侧区，间接⾄内侧区。

（2）来⾃各感觉性脑神经核前庭神经核、孤束核、三叉神经脑桥核和脊束核以及听、视和嗅觉纤维⾄⽹状结构外侧区再达内侧区。（3）来⾃⼤脑⽪质⽹状纤维主要是额叶，也有⽪质其它部分。其纤维⼤部分随⽪质脊髓束⾄内侧区，主要终⽌于桥嘴侧⽹状核和延髓巨细胞⽹状核。（4）来⾃边缘系统各部如隔区、杏仁体和海马。（5）纹状体⽹状纤维

苍⽩球——⾖状核——红核背侧⽹侧结构。

壳、苍⽩球和未定带——⾖状核——中脑尾侧被盖外侧⽹状结构。（6）下丘脑⾄⽹状结构乳状体——中脑被盖

室旁纤维——中脑⽔管周围的灰质

（7）上丘脑⾄⽹状结构缰核——缰核脚间束中脑被盖腹侧部和及脑桥上部⽹状结构。

（8）⼩脑⾄⽹状结构的纤维⼩脑传出纤维⾄脑⼲⽹状结构全长，它和⽹状结构的其它传⼊系统有⼴泛的重叠，并且与⽹状结构的上、下⾏神经元有⼤量的联系。2．传出纤维联系

（1）下⾏⽹状脊髓束始⾃脑桥、延髓⽹状结构的内侧区及中脑⽹状结构（主要为巨细胞⽹状核的全长及腹侧⽹状核的嘴侧端、桥嘴侧⽹状核的尾侧部、桥尾侧⽹状核的嘴侧部），终⽌于脊髓全长的躯体和内脏运动核。⽹状结构还有纤维⾄全部脑⼲运动核和部分感觉核。（2）上⾏⽹状径路