基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用

维普资讯 http://www.cqvip.com 现代农业科技｝２００８年第１６期　动物科学　基因文库构建及其在鱼类遗传研究上的应用　刘星　仇雪梅　高祥刚　赫崇波　ｆ‘辽宁大连水产学院生命科学与技术学院，辽宁大连１１６０２３；　辽宁省海洋水产科学研究院）　摘要综述了基因文库的类型以及鱼类基因文库的构建及其应用。通过构建ｃＤＮＡ表达文库不但可以保护濒危珍稀生物资源，而且　可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针：ｃＤＮＡ文库的构建将在鱼类分子生物学方面起到更多的作用。　关键词基因组；基因文库；ｃＤＮＡ文库；鱼类；应用　￥９１７　文献标识码Ａ　文章编号１００７—５７３９（２００８）１６—０２４７—０３　一中图分类号一个生物体的基因组ＤＮＡ用限制性内切酶部分酶切　个基因文库中应包含的克隆数目与该生物的基因组　后，将酶切片段插入到载体ＤＮＡ分子中，所有这些插入了　基因组ＤＮＡ片段的载体分子导入到受体细菌或细胞中，这　样每个细胞就包含了１个基因组ＤＮＡ片段与载体重组　ＤＮＡ分子，形成了含有该生物全部基因组序列的细胞集合　体，我们将这个集合体叫做基因文库。　构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定　的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基　因的主要途径。对于复杂的染色体ＤＮＡ分子来说，单个基　因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出　来，一般需要先进行扩增，所以需要构建基因文库¨１】。这个文　库像是一个贮存有基因组全部序列的信息库，故称为基因　组文库（Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｙ）ｔ￣。为了有效地保存基因文库，可通　过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定ＤＮＡ片段　的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需　基因的ＤＮＡ片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这　样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的ＤＮＡ片　段。建立和使用基因文库是高等真核生物基因分离、基因定　位和基因工程研究的有效手段。　１基因文库的类型　从序列来源上分，基因文库可分为基因组文库和ｃＤＮＡ　基因文库（ｃＤＮＡ文库）。基因组文库是指一个生物体的基　因组ＤＮＡ用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到　载体后所形成的基因组ＤＮＡ，基因组文库根据ＤＮＡ来源　又有核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文　库。ｃＤＮＡ文库是指某生物某一发育时期所转录ｍＲ　ＮＡ经　反转录形成的ｃＤＮＡ片段与某种载体连接而形成的基因文　库圈。目前基因组文库和ｃＤＮＡ文库在基因工程中都得到有　效应用。ｃＤＮＡ便于克隆和大量表达，它不像基因组ＤＮＡ　含有内含子而难以表达，可以直接筛选到所需的目的基因，　并用于该目的基因的表达　。因此，在分离Ｒ＿ＮＡ病毒基因、　研究功能蛋白序列、分离特定发育阶段或特定组织特异表　达基因时应构建ｃＤＮＡ文库。在研究ｍ＿￣ＮＡ分子中不存在　的序列及基因组作图时必须构建核基因组文库。　基金项目　国家海洋科技推**台与运行项目（２００７—２００９）资助。　作者简介刘星（１９８３一），男，河南信阳人，硕士研究生。研究方向：水产　动物分子遗传学。　￥通讯作者　收稿日期２００８—０６—１９　大小和被克隆ＤＮＡ片段的长度有关。原核生物的基因组较　小，需要的克隆数也较少；真核生物的基因组较大，克隆数　需相应增加，才能包含所有的基因。此外，每一载体ＤＮＡ中　所允许插入的外源ＤＮＡ片段的长度较大，则所需总克隆数　越少：反之则所需数越多。如果一个基因文库的总克隆数较　少，则从中筛选基因虽然比较容易，但会给以后的分析造成　困难，因为片段的长度增加了。所以在建立基因文库前应根　据研究目的来确定ＤＮＡ片段的长度和克隆数目，并以此确　定构建基因文库的载体种类。　早期人们使用　噬菌体和粘粒（ｃｏｓｍｉｄ）作为克隆载体，　但是二者容纳外源ＤＮＡ片段的最大能力分别是２５Ｋｂ和　４５Ｋｂ，只适用于一般基因的克隆　。通常认为，噬菌体文库较　质粒文库更加稳定和易于筛选。但是提取高质量的噬菌体　ＤＮＡ以便分析连接在载体上的插入片段的工作是非常困　难的，而质粒载体便于基因克隆和测序分析等方面的操作围。　噬菌体载体和粘粒载体是早期构建真核细胞基因组　文库的两类载体。随着分子生物学的飞速发展，建库的对象　由模式动物到全部生物界。所研究生物的基因组从小到大，　而这两类载体存在克隆位点少、插入容量较小和筛选工作　量大的嗣题。２０世纪８０年代后期，随着人工染色体载体系　统的应运而生，这些问题得到解决。　２人工染色体文库　人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基　因组的功能元件构建的能克隆大于５０Ｋｂ　ＤＮＡ片段的人工　载体。目前，根据目标ＤＮＡ片段的大小。基因组文库构建常　用的载体有黏粒载体、Ｐ１噬菌体载体、ＰＡＣ载体（Ｐ１人工染　色体）、ＢＡＣ载体（细菌人工染色体）和ＹＡＣ载体（酵母人工　染色体）。选用何种载体主要考虑以下几个因素：如果基因　组的目标区域很小（小于５０Ｋｂ），那么可以选择黏粒载体甚　至是　噬菌体载体。利用现有的商品化的黏粒载体、高效率　的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株，研究者可以方便地　构建黏粒载体文库。如果基因组的目标区域比较大，那么　Ｐ１、ＰＡＣ或者ＢＡＣ就比较合适了。Ｐ１操作比较困难，ＰＡＣ　相对简便。ＢＡＣ载体也是很好的选择，研究者可以利用现有　的成熟产品来构建ＢＡＣ文库，比如ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ公司的一　系列ＢＡＣ载体及配套试剂盒。如果目标区域非常大（大于　２５０Ｋｂ），那么ＹＡＣ载体就是首选。不过，应用ＹＡＣ载体来　２４７　维普资讯 http://www.cqvip.com

动物科学　《现代农业科技｝２００８年第１６期　构建基因组文库，操作非常繁琐困难，一般由专门的公司来　完成。Ｍｕｒｒａｙａ和Ｓｚｏｓｔａｋ首次成功构建了包括着丝粒、端　粒、复制子和外源ＤＮＡ在内的总长度为５５Ｋｂ的酵母人工　染色体（Ｙｅａｓｔ　ａ￣ｉｉｆｃｉｌａ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）［６１。Ｂｕｒｋｅ等构建了　能克隆大片段人体ＤＮＡ分子的载体，即ＹＡＣ，并证明ＹＡＣ　是普通探针所不能发现的稀有转录区；③与原始丰度的　ｍＲＮＡ拷贝数相对应的ｃＤＮＡ探针与标准化的ｃＤＮＡ文　库作杂交，可估计出大多数基因的表达水平及发现一些组　织表达特异的基因㈦。　３．３消减ｃＤＮＡ文库　可用来构建高等生物的完整基因组文库，插入片段比通常　所用的　噬菌体、Ｃｏｓｍｉｄ等载体的容纳能力至少大１０倍ｆ７ｊ。　要产生消减ｃＤＮＡ文库，抑制性消减杂交（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是最有效、最流行的方法之一。　但是，ＹＡＣ不仅存在着重排和缺失现象，而且其插入片段　的分离较难，转化效率低，同时其嵌合体问题尤为严重，使　其在应用和研究工作中受到了很大限制嘲。因此，建立一种　容量大，能够稳定遗传且易于操作的载体系统就成了分子　可以用这种有效的技术来比较２个ｍＲＮＡ群体，并获得只　在一个群体中过量表达或特异性表达的基因ｃＤＮＡ。这项　技术还可以用来比较基因组ＤＮＡ群体。抑制性消减杂交技　术是１９９６年ＤｉａｔｃｈｅｎｋＯ等Ⅱ犍立的。该方法是基于Ｌｕｋｙａｎｏｖ　生物学研究的重要内容。２０世纪９０年代发展起来的细菌人　工染色体（ＢＡＣ），使人们的愿望成了现实。ＢＡＣ构建的基　础是Ｅ．ｃｏｌｉ及Ｆ因子。Ｆ因子在Ｅ．ｃｏｌｉ中的复制受到严格控制　而保持低拷贝，一般为每细胞单拷贝或２个拷贝。此外，Ｆ因　子具有携带１Ｍｂ插入片段的潜能，这就使得以此为基础、　构建具有大容量克隆能力的ＢＡＣ载体成为可能。１９８９年，　Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ等首次用“染色体建造”的方法，利用Ｆ因子构建　载体ｐＭＢＯ１３１来克隆大片段ＤＮＡ，目前常用的载体有　ｐＥＣＢＡＣ１、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１等　。　３　ｃＤＮＡ文库　３．１经典ｃＤＮＡ文库　自１９７６年Ｅｆ￣ｔｒａｔｉａｄｉｓ等　报道成功地进行了ｃＤＮＡ的　分子克隆，ｃＤＮＡ合成和克隆方法不断改进，与之相适应的　ｃＤＮＡ文库也得到不断改善。经典ｃＤＮＡ文库是以带有多　聚腺苷酸的ｍＲＮＡ为模板，在反转录酶的作用下合成　ｃＤＮＡ第１链，再用适当的方法合成ｃＤＮＡ第２链，加入合　成接头后，把ｃＤＮＡ克隆到能在细菌中扩增的载体中　”。随　着分子生物学的发展，ｃＤＮＡ文库的构建方法在模板制备、　ｃＤＮＡ合成效率和克隆载体等方面取得了很大进展。但经　典ｃＤＮＡ文库仍存在不足：①低丰度表达序列在文库中出　现的机率很低：②构建经典ｃＤＮＡ文库所需要的ｍＲＮＡ量　大，达数微克；③筛选经典ｃＤＮＡ文库工作复杂，需要很长　时间，限制了基因克隆的速度㈣。　３．２标准化ｅＤＮＡ文库　在绝大多数细胞中，基因表达均存在差异。表现在　ｍＲＮＡ上，就是在任意时刻。细胞内的各种ｍＲＮＡ丰度都　存在较大差别，反映在使用通用方法制成的ｃＤＮＡ文库，即　直接ｃＤＮＡ文库（ｄｉｒｅｃｔ　ｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ）上，就是文库中大多　数克隆都是重复的、冗余的㈣。对单一组织的ｃＤＮＡ文库而　言，高拷贝基因序列的大量存在给基因的筛选和鉴定带来　不必要的浪费。因此，就出现了标准化ｃＤＮＡ文库。　标准化ｃＤＮＡ文库（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ）又称为等　量化ｃＤＮＡ文库，即某一特定组织或细胞的所有表达基因　均包含其中、且含量相等的ｃＤＮＡ文库。这种文库主要有３　个方面的优点：①增加克隆低丰度ｍＲＮＡ的机会，适用　于分析分化发育阶段的基因表达及突变检查；②等量化　的ｃＤＮＡ可做探针来发现基因组序列中的转录区，尤其　２４８　等提出的抑制ＰＣＲ效应ｌ１５】。这个方法的关键特征是，同时　进行标准化于消减步骤，标准化步骤使目的样品中的ＤＮＡ　片段含量相等，消减步骤则排除了所比较的２个样品中的　一致序列ｌ１６】。ＳＨＨ除去了任何需要物理方法分离单链（ＳＳ）　ＤＮＡ与双链（ｄｓ）ＤＮＡ的中间步骤，只需要１轮消减杂交，　即可以使差异表达的ＤＮＡ片段富集１　０００倍以上。该技术　与其他消减杂交技术相比具有假阳性率低、敏感性高、效率　高等优点而得到广泛应用　。　４鱼类基因文库构建及其应用　鱼类基因组文库的构建对鱼类功能基因的研究具有重　要意义。Ｑｕｉｎｉｏｕ等㈣利用ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１载体建立了斑点叉　尾鲴（Ｌｅｔａｌｕｒｕｓｐｕｎｃｔａｔｕｓ）含有５３　５００个克隆的ＢＡＣ文库，平　均插入片段长度为１１３￣１６５ｋｂ，具有７．２倍的斑点又尾鲴单　倍体全基因组覆盖率。这个ＢＡＣ文库已经用于斑点叉尾鲴　基因组物理图谱的构建和重要生长性状基因的鉴定研究　。　Ｌｕｏ等闲构建了含有３１３３４４个克隆、覆盖护士鲨（Ｇｉｎｇｌｙ—　ｍｏｓｔｏｍａ　ｃｉｒｒａｔｕｍ）全基因组１１倍的ＢＡＣ文库，其平均插入　ＤＮＡ片段长度１４４Ｋｂ，通过ＢＡＣ末端测序不仅发现了在　其他动植物基因组中普遍存在的ＬＩＮＥｓ和ＳＩＮＥｓ结构，而　且还发现了护士鲨所特有的２个重复元件ＮＳＫＥ１和　ＮＳＲＥ２。进一步分析表明，该基因组文库适用于构建护士　鲨的基因组物理图谱。　鲤鱼是我国重要的养殖鱼类之一，是基因组最大的鱼　类，在进化上也具有重要的研究价值。耿波『２１１首次构建了黑　龙江野鲤的ＢＡＣ文库，该库含有４６　６５６个克隆，插入片段　大小在５０￣３００Ｋｂ之间，平均大小在１００Ｋｂ左右，覆盖鲤鱼　全基因组２．４５倍，克隆载体为ｐＥＺＢＡＣ，大小为７．２Ｋｂ。获得　的ＢＡＣ克隆，保存在３７８块９６孔板和２７块３８４孔板中。使　用８对引物（８种基因）对黑龙江野鲤ＢＡＣ基因组文库进行　筛选，并建立了２步３维ＰＣＲ、荧光原位杂交技术和染色体　显微切割技术等ＢＡＣ文库筛选和基因组分析方法。黑龙江　野鲤ＢＡＣ文库的构建，为进一步开展鲤鱼基因组、功能基　因组及蛋白质组研究建立了基础。　ｃＤＮＡ文库的构建是研究基因表达和鉴定的主要手段　之一　杨明等圄以细菌攻毒的真鲷鳃组织为材料，分离出　ｍＲＮＡ，合成双链后，回收５００￣４　０００　ｂｐ　ｃＤＮＡ片段，构建了　ＲＺＡＰ表达型ｃＤＮＡ文库。初级文库的容量为１．７５ｘ１０　个重　维普资讯 http://www.cqvip.com 《现代农业科技》２００８年第１６期　动物科学　２００５，１６（６）：６６８－６７１．　组子，扩增文库的滴度达到１ｘ１０９ｐｆｕ／ｍＬ，随机挑选噬菌斑　的插入片断在５００￣２　０００ｂｐ之间。鲍宝龙等　通过探针杂交　筛选斑点叉尾细ＢＡＣ基因组文库，利用引物步移的方法对　阳性克隆ＢＡＣ０４７＿Ｋ１２进行序列测定，得到２８１５　ｂｐ的　［２］方德福．医学分子生物学字典［Ｍ］．北京：北京医科大学、中国协和医　科大学联合出版社，１９９６．　［３］晏慧君，黄兴奇，程在全．ｃＤＮＡ文库构建策略及其分析研究进展Ⅱ】．　云南农业大学学报，２００６，２１（１）：１－６．　ＳＣＹＡ１２６基因组序列。序列分析表明，ＳＣＹＡ１２６基因由２　个外显子和１个内含子组成。赵艳景等利用鲨鱼再生２４ｈ　【４］ＳＡＭＢＲＯＯＫ　Ｊ，ＦＲＩＴＳＣＨ　Ｅ　Ｆ，ＭＡＮＩＡＴＩＳ　Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ［Ｍ］．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９．　【５］吕蓓，郑景生．基因表达文库的构建及其方法分析叽分子植物育种，　的鲨鱼肝组织，分离了再生肝组织的总ＲＮＡ，成功构建了　鲨鱼再生肝组织ｃＤＮＡ文库，这为后续通过差异显示技术　获得鲨鱼肝再生差异表达基因的ＥＳＴ序列获得差异表达基　因的ｃＤＮＡ全序列，进而研究它们的功能，奠定了一个良好　的工作基￣［２４１。李旭霞等以日本七鳃鳗唾液腺为材料，应用　Ｇｕｂｌｅｒ和Ｈｏｔｆｍａｎ技术方法，构建以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ（＋）载　体为基础的日本七鳃鳗唾液腺ｃＤＮＡ筛选文库。该文库保　留了日本七鳃鳗唾液腺中蛋白质的分子信息，为进一步研　究其组分和作用机理奠定了基础阎。梁利群等利用抑制消减　杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减ｃＤＮＡ文　库，共含有２　０００个克隆。对其中４８０个克隆进行斑点杂交　筛选，共得到６０个阳性克隆，选取其中２９个克隆测序。通　过序列分析比对，１３个克隆与已知基因序列高度同源，同源　性为８５％￣９８％；另外的１３个克隆为未知新基因序列　。　鲍宝龙等采用抑制差减杂交法。以变态前的牙鲆仔鱼头部　表达的ＲＮＡ作为驱动ＲＮＡ，建立了变态早期的差减　ｃＤＮＡ文库。并利用相对定量ＲＴ－ＰＣＲ对其进行了筛选。　差减文库的平均插入片段５５８　ｂｐ左右，阳性率为８１．８％。随　机测定的４５个克隆，在剔除假阳性克隆后，共得到２２个不　同的基因　。　５展望　基因组文库具有十分广泛的用途，如用于分析、分离特　定的基因片段，用以基因表达调控、基因组工程和基因组物　理图谱构建等研究．对于重要的濒危物种或珍稀物种的基　因组文库的构建非常重要。在构建基因组文库时，由于ＢＡＣ　具有容量大、稳定遗传、易于操作的载体系统。在Ｅ．ｃｏｌｉ中的　复制受到严格控制而保持低拷贝（一般为每细胞单拷贝或　２个拷贝）。因此ＢＡＣ是基因组文库构建的主要首选载体。　但是，由于基因组文库的构建过程比较复杂，耗时长，耗资　较高，所以不适合一般的基因鉴定和筛选研究。　ｃＤＮＡ文库由于是不含内含子的表达基因文库，可直　接从中筛选到所需的目的基因，克隆全长基因进而开展基　因功能研究，因此构建ｃＤＮＡ文库是研究功能基因组学的　基本手段之一。通过构建ｃＤＮＡ表达文库不仅可以保护濒　危珍稀生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的　所用探针。因此，ｃＤＮＡ在研究具体某类特定细胞中基因组　的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势。　从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和　死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是　水产分子遗传学研究工作中最常使用到的基因文库．ｃＤＮＡ　文库的构建将在鱼类分子生物学方面起到更多的作用。　６参考文献　…晓虹，金黎明．细菌人工染色体文库的构建及应用卟生物技术通报，　２００３，１（５）：７５１－７５５．　【６］ＭＵＲＲＡＹＡ　Ｗ，ＳＺＯＳＴＡＫＪ　Ｗ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆａｒｔｉｉｆｃｉｌａ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８３（３０５）：１８９—１９３．　【７］ＢＵＲＫＥ　Ｄ　Ｔ，ＣＡＲＬＥ　Ｇ　Ｆ，ＯＬＳＯＮ　Ｍ　Ｖ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆｌｒａｇｅｒ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ　ｏｆＥｘｏｇｅｎｏｕｓ　ＤＮＡ　ｉｎｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｂｙ　Ｍｅａｎｓ　ｏｆＡｒｔｉｉｆｃｉｌａ　Ｃｈｏｍｏｓｏｍｅ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ⅱ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７（２３６）：８０６—８１２．　【８］ＡＮＤＥＲＳＯＮ　Ｃ．Ｇｅｎｏｍｅ　ｓｈｏｒｔｃｕｔ　ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｐｒｏｂｌｅｍｓＵ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９３　（２５９）：１６８４—１６８７．　【９］李海权，刁现民．基因组细菌人工染色体文库（ＢＡＣ）的构建及应用　Ⅱ］．生物技术通报，２００５（１）：８－１３．　【１０】ＥＦＳＴＲ＿ＡＴＩＡＤＩＳ　Ａ，ＫＡＦＡＴＯＳ　Ｆ　Ｃ，ＭＡＸＡＭ　Ａ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｉｎｖｉｔｒｏ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆｇｌｏｂｉｎｇｅｎｅｓⅡ】．Ｃｅｌｌ，１９７６（７）：２７９—２８８．　【１１】Ｊ．萨姆布鲁克，Ｅ．Ｆ弗里奇，Ｔ．曼尼阿蒂斯．分子克隆实验指南（第２　版）［Ｍ］．金冬雁，黎孟枫，译．北京：科学出版社，１９９３．　【１２］李海红，王秦秦．ｃＤＮＡ文库的构建策略Ⅱ】．昆明医学院学报，２００３　（４）：２２－２５．　【１３］王强，刘秋云，李宝健．发现新基因的高效方法－ｃＤＮＡ文库的复性　式均一化技术Ⅱ】．遗传，２００２，２４（３）：３２５－３２８．　【１４］ＤＬＡＣＨＥＮＫ　Ｏ，ＬＡＮ　Ｙ　Ｆ，ＣＡＭＩＰＢＥＬＬ　Ａ　Ｐ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｏｒ　ｔｉｓｓｕｅ—ｓｅｐｅｃｉｉｆｃ　ｃＤＮＡ　ｐｒｏｂｅ　ａｎｄ　ｈｂｒａｒｉ￣Ｕ］．Ｐｒｏｅ　Ｎｃａｄ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，１９９６，９３（１２）：６０２５．　【１５］ＬＵＫＹＡＮＯＶ　ＳＡ，ＧＵＲＳＫＡＹＡＮＧ．，ＬＵＫＹＡＯＶＫＡ，ｅｔ　ａ１．Ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｉｄｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｕ］．Ｊ　Ｂｉｏｏｒｇ　Ｃｈｅｍ，１９９４　（２０）：３８６－３８８．　【１６］ＧＵＲＳＫＡＹＡＮＧ，ＤＩＡＴＣＨＥＮＫＯＬ，ＣＨＥＮＣＨＩＫＡ，ｅｔａ１．Ｅｑｕａｌｉｚｉｎｇ　ｃＤＮＡ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆＪｕｒｋａｔ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ　ａｎｄ　ｐｈｏｒｂｏｌ　１２一ｍｙｒｉｓｔａｉｅ　１３一ａｃｅｔａｉｅ…．Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９６，２４０　（１）：９０－９７．　【１７］杨倩，成军，刘妍，等．抑制性消减杂交技术原理及应用卟世界华人　消化杂志，２００３，１１（４）：４５６－４５８．　【１８］ＱＵＩＮＩＯＵ　Ｍ　Ａ，ＫＡＴＡＧＩＲＩ　Ｔ，ＭＩＬＬＥＲ　Ｗ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．，Ｃｏｎｓｔｕｒｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆａ　ＢＡＣ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｆｒｏｍ　ａ　ｇｙｎｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｃａｔｉｆｓｈ　Ｉｃｔａｌｕｍｓ　ｐｕｎｃ￣ｔｕｓⅡ】．Ｇｅｎｅｔ　ＳｅｌＥｖｏｌ，２００３（３５）：６７３—６８３．　【１９］ＷＡＮＧ　Ｓ，ＸＵ　Ｐ，ＴＨＯＲＳＥＮ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＢＡＣ　ｌｉｂｒａｒｙ　ｆｒｏｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｃａｔｉｆｓｈ　Ｉｃｔａｌｕｍｓ　ｐｕｎｃｔａｔｕｓ：ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆｈｉｇｈ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ　ａｍｏｎｇ　ｔｅｌｅｏｓｔ　ｇｅｎｏｍｅｓ［Ｊ】．Ｍａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（ＮＹ）．２００７，９（６）：７０１—７１１．　［２０１　ＬＵＯ　Ｍ，ＫＩＭ　Ｈ，ＫＵＤＲＮＡ　Ｄ，ｅｔ　ａ１．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｕｎｅ　ｓｈａｒｋ　（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ　ｃｉｒｒａｔｕｍ）ｂａｃｔｅｒｉｌａ　ａｒｔｉｆｉｃｉｌａ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）ｌｉｂｒａｒｙ　ａｎｄ　ａ　ｐｒｅｈｍｉｎａｒｙ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｕｒｖｅｙⅡ】．ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００６（７）：１０６．　［２１］耿波．黑龙江野鲤细菌人工染色体基因组文库的构建及在基因组研　究中的应用ｆＤ］．长春：吉林大学，２００７．　［２２］杨明，王克坚，曲海东，等．真鲷鳃组织ｃＤＮＡ文库的构建与　ｈｅｐｃｉｉｄｎ抗菌肽基因序列的扩增Ｕ】．水产学报，２００６，３０（５）：６２７—　６３２．ｔ　［２３］鲍宝龙，李家乐，汪桂玲，等．斑点叉尾鲴趋化因子ＳＣＹＡ１２６基因及　其可变剪接Ⅱ】．中国水产科学，２００７，１４（１）：１－７．　［２４］赵艳景，胡亚楠，刘睿，等．条纹斑竹鲨鱼再生肝组织ｃＤＮＡ质粒文　库的构建和鉴定Ⅱ】．高技术通讯，２００５，１５（５）：８２—８６．　［２５］李旭霞，逢越，肖蓉，等．日本七鳃鳗（Ｌａｍｐｅｔｒｓｊａｐｏｎｉｃａ）唾液腺　ｃＤＮＡ文库的构建叨．辽宁师范大学学报（自然科学版），２００４，２７　（１）：７３—７５．　［２６］梁利群，李绍戊，常玉梅，等．抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中　的应用Ⅱ］．中国水产科学，２００６，１３（２）：１９３－１９９．　【２７］鲍宝龙，杨桂梅，施志仪，等．抑制差减杂交法克隆牙鲆变态早期差　异表达的基因Ⅱ】．水产学报，２００６，３０（２）：２０４－２１０．　２４９