高效液相色谱法在手性药物对映异构体拆分中的应用

随着不对称合成技术及手性拆分技术日趋成熟，手性药物研究已经成为新药研发的一大热点。由于手性药物的对映体之间在药效学、药代动力学等方面存在较大差异，因此建立手性拆分的质量控制方法十分重要。

一、什么是手性异构和对映异构体

当药物分子中碳原子上连接有4个不相同的基团时，该碳原子被称为不对称碳或手性碳（中心），会导致药物分子存在异构体，如果两个异构体之间的关系如同一个物体的立体结构在照镜子，这个立体结构和它在镜子中的像互为对映异构体（对映体）。图1是手性对映异构体的图示。

图1手性对映异构体图示

对映体具有相同的物理性质（如熔点，沸点，溶解度，折射率，酸性，密度等），热力学性质（如自由能，焓、熵等）和化学性质。除非在手性环境（如手性试剂，手性溶剂）中才表现出差异。对映体对偏振光的作用不同，它们的比旋光度数值相同，但方向相反。对映体的生物活性不相同，化学反应中表现出等速率。

等量的左旋体与右旋体的混合物构成外消旋体。从对映体中分离出单纯一个光学异构体的方法称手性拆分。最普通的手性拆分方法是消旋旋体与光学活性相反的离子（称拆分剂）作用生成非对映体。手性药物对映体拆分的方法主要有非色谱法和色谱法。

非色谱法（主要包括结晶法、微生物消化法等）耗时长，过程繁琐不能制备高纯度对映体，色谱法是基于把对映体的混合物转换成非对映异构体，然后利用它们在化学或物理性质上的差异进行分离。 主要包括气相色谱(GC)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)和毛细管电色谱(CEC)等。表1罗列了色谱手性拆分的发展史。其中高效液相色谱(HPLC)因其独特的优势成为手性分析领域最常用的一种技术。

表1色谱手性拆分发展史 年份 1939年 1952年 里程碑

Henderson和Rule在乳糖上色谱分离外消旋樟脑衍生物 Dalgliesh：提出氨基酸在纸色谱上光学分离的三点作用假设 1966年 1971年 1972年 1973年 1973年 Gil-Au等：用GC直接分离对映体 Davankov和Rogozhin：引入手性配体交换色谱 Wulff和Sarhan：制备出手性LC的酶模拟聚合物 Hesse和Hagel：制备出手性拆分的纤维素三乙酸酯 Stewart和Dherty：把琼酯糖键合的牛血清清蛋白（BSA）用于手性拆分 1974年 Blaschke：由光学活性单体合成出用手性LC的手性聚合物 1975年 1979年 Gram等：用手性冠醚发展出主-客体色谱 Dirkle和House：合成出第一个硅胶键合手性固定相，并应用于手性LC分离 1979年 1982年 1983年 1984年

Okamoto等：合成出手性LC的螺旋形聚合物 Allenmark等：把琼酯键合的BSA用于手性LC Hermansson：把硅胶键合的a1-酸糖蛋白用于手性拆分 Armstrong和DeMond：制备出硅胶键合环糊精固定相

二、HPLC手性拆分方法

手性药物拆分法通常分为直接法和间接法两大类。间接法和直接法的共同特点是均以现代技术为基础并引人不对称中心或光活性分子；不同的是间接法是将其引入分子溶质内，而直接法则是引人分子间。引人手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异是手性进行光学异构体拆分的基础。 1、间接法

药物对映体在分离前，先与具有高光学纯度的手性衍生剂反应，在药物对映体中引入第二个手性中心，形成非对映异构体，溶质分子与流动相和固定相之间的作用力不同，发生差速迁移以常规或手性固定相进行分离称为间接法，也称手性衍生化试剂法（CDR）。

图2 CDR原理图示 常用的手性衍生试剂 表2常用手性衍生剂 手性衍生试剂

简述

与大多数醇类和胺类化合物反应，形

异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯(IC)成相应的氨基甲酸酯或脲的非对映类

体。如麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素抗结剂、儿茶胺类

其结构特征有利于提高立体选择性，同时此类化合物具有很强的紫外吸

萘衍生物类

收，用UV检测器可大大提高检测灵敏度，在CDR应用十分广泛。

羧酸衍生物类

主要包括酰氯与磺酰氯类、酸酐类和

率甲酸酯类。它们的手性碳位于羧基的α位，可与胺、氨基酸及醇类药物反应生成非对应异构体。

主要用于衍生化羧酸类、N-保护氨基

胺类

酸、醇类药物

2、直接法

直接法是在HPLC系统中引入“手性识别器”或手性环境，以形成暂时的非对映体异构体复合物，根据其形成复合物的稳定系数不同而获得分离。直接法分为手性流动相法（CMP）和手性固定相法（CSP）。 （1）手性流动相法（CMP）

在流动相加入手性添加剂（CMPA），与对映体生成一对非对映络合物，在普通色谱柱上进行分离。手性添加剂与溶质生成的络合物虽然不及衍生化法形成的衍生物牢固，但所依据的手性识别作用络合物的非对映异构体性质却基本相同。

图3 CMP原理图示 常用的手性添加剂 表3常用手性添加剂 手性添加剂

简述

在众多手性添加剂中以该类添加剂的基础理论研究较成熟，应用也较广。手性配体多为光活性氨基酸或其衍生物。它们和二价金属离子

配体交换型手性添加剂

螯合，以适当的浓度分布于流动相中遇药物消旋体，共同形成配位络合物对，然后在反相或正相柱上完成拆分。

环糊精是由吡喃葡萄糖通过α-(1,4)-连接构

环糊精添加剂

成的环状低聚糖其分子呈截头圆锥状，边缘排列有许多羟基，内部则是相对疏水的空腔。如

果待分析化合物的分子大小与空腔相符合，则可形成环糊精包合物，具有对溶剂分子基团体积直径的选择性及其手性识别作用，颇有应用前景。

荷电药物能与手性离子对缔合成电中性络合物，即离子对分布于固定相上，其保留特征可

手性离子对添加剂

采用手性离子对浓度及其种类调节外，还可由外加的手性络合剂控制。

（2）手性固定相法（CSP）

手性固定相法是基于样品与固定相表面的手性选择剂形成暂时的非对映体配合物的能量差异或稳定性不同而达到手性分离。是不经过转变成非对映体的直接拆分的方法。

图4 CSP原理图示

（a）CSP种类 表4 CSP种类 类型

简述

通过含末端羧基或异氰酸酯基手性前体与氨基键合硅胶进行缩合反应，分别形成含酰胺或脲型结构。应用

Pirkle型

于氨基酸、乙内酰脲、内酰脲、胺类、醇类及硫醇类药物对映体。

环糊精的手性识别主要来自环内控对芳烃或脂肪烃类侧链的包容作用，以及环外壳上的羧基与药物对映体

环糊精

分子发生氢键作用。β-环糊精适用于大多数药物，γ-环糊精适用于较大相对分子质量的药物，α-环糊精-适用于相对分子质量小于200的药物。

主要来自氨基甲酸酯或酯的部位与被拆分物之间形成氢键或偶极~偶极作用，或通过被拆分物分子进入纤维

多糖类

索网状腔，导致腔内立体环境的改变而实现。主要用于分离巴比妥类药物、麻醉药和抗抑郁药等。 可识别药物对映体在蛋白质的结合位点而达到手性分

蛋白质类

离。可直接分离许多药物，如硫喷妥因，心得怡及阻滞剂等

3.三种手性拆分方法的比较 表5三种手性拆分方法比较 方法

优点

局限性

可以使用已有的非手性固定手性试剂需要有高的光学纯

相，花费少，通过选用具有强度，各对映体的衍生化速率烈紫外吸收或荧光吸收的手

CDR

及平衡常数应一致，要求衍

性试剂，可提高检测灵敏度，生化反应迅速、彻底。步骤而且多数的衍生化试剂具有良好的对热及水的稳定性

较繁琐、衍生化试剂毒性较大，很难实现分析方法的自动化。

不必做柱前衍生化，对固定相应用范围有限，某些添加剂无特殊要求，样品的非对映异不够稳定而且会干扰检测

CMP

构化络合具有可逆性且利于制备

能够广泛适用于各类化合物，有些样品需要做柱前衍生适用于常规及生物样品的分

CSP

析测定，制备分离方便，定量制。其适用性尚不及高效液分析的可靠性高。

4.结语

高效液相色谱法具有快速、分离效果好、检测灵敏度高及可配备选择性强、灵敏度高的不同检测器、检测自动化等特点。对于定量分析和制备分离都是应用最为广泛的一种技术。未来高效液相色谱法在手性分析领域的发展有望集中在深入研究手性识别机制，为快速筛选出合适的分析或制备方法提供明确的理论依据；寻找新材料应用于手性选择剂和色谱柱填料中;同时也是色谱学研究重要的分支。在手性色谱

相色谱仪固定相那样广泛。 化，对样品结构有一定的限

学中，无论是间接法还是直接法都有各自的优点和局限性，它们在药物科学中的应用也是互相补充、各具特色。我们应根据被测药物的结构和性质，选择适当的方法对其进行有效的拆分，为手性药物研发和质量控制提供可靠保障，不断促进手性药物的发展。