加味玉屏风散对创伤应激小鼠IL-2 与IL-2R基因表达影响的形态计量学研究

94 CHINESE JOURNAL OF STEREOLOGY AND IMAGE ANALYSIS Vol.8 No.2 Jun.2003

文章编号：１００７－１４８２（２００３）０２－００９４－０３　

加味玉屏风散对创伤应激小鼠ＩＬ－２与ＩＬ－２Ｒ　

基因表达影响的形态计量学研究　

曾广仙 ，刘俊英

（解放军第四五七医院病理科，武汉 430012）

　【摘要】目的：探讨加味玉屏风散对创伤应激小鼠脾淋巴细胞IL-2与IL-2R基因表达的影响。方法：应用体外细胞培养和Northern印迹法图像分析仪定量检测了加味玉屏风散对刀豆蛋白Ａ(ＣonA)诱导的小鼠脾淋巴细胞IL-2与IL-2R基因表达的影响。结果：发现加味玉屏风散体内应用对创伤应激小鼠IL-2mRNA及IL-2RmRNA水平均具有明显的升高作用。结论：加味玉屏风散可通过促进创伤应激小鼠脾淋巴细胞IL-2及IL-2R的基因转录表达进而逆转IL-2及IL-2R的抑制状态。

【关键词】玉屏风散；白细胞介素 - 2；白细胞介素 - 2受体；基因表达 【中图分类号】R917 R285.5 【文献标识码】B

EFFECT OF MODIFIDE JADE SCREEN POWDER ON WOUNDED

STRESS MICE IL-2 AND IL-2R GENIC EXPRESSION

ZENG Guang-xian, LIU Jun-ying

(Department of pathology,NO. 457 Hospital of PLA,Wuhan 430012)

【ABSTRACT】 objective：To survey the effects of Modified Jade Screen Powder on IL-2 and IL-2R genic expression of mice spleen lymphocyte. Methods：Using canavaline A induced IL-2 and IL-2R to express of mice spleen lymphocyte cultured in vitro.Detected by Norther blot. Results：Modified Jade Screen Powder used in vivo significantly improve IL-2mRNA and IL-2RmRNA level. Conclusion: Modified Jade Screen Powder can reverse the inhibition of wounded mice spleen lymphocyte.

【KEYWORDS】 Modified Jade Screen Powder; interleukin-2; interleukin-2 receptor; genic expression

严重的创伤可以抑制机体的免疫功能，而以细胞免疫受抑为主[1-2]。我们在以往的研究中已观察到加味玉屏风散对创伤小鼠的细胞免疫功能均具有明显的恢复作用[3 ,4 ]，但对其提高创伤小鼠细胞免疫功能的机理尚不清楚。本实验对此进行了探讨。

材公司提供。加味玉屏风散（HJY）由黄芪、党参、白术、防风按3：2：1：1比例构成。按1：30加水浸1小时，第1、2煎文火煮40min，第3煎煮20min，再将3次前液混合成160%的药液，置4℃冰箱贮存备用。 1.2主要试剂

RNA提取试剂盒：TRIZOL试剂盒(Gibcol,No.15596-026);质粒提取试剂盒:(Promega:Wizard Minipreps DNA,No.117);DNA片断提取试剂盒:(La Jolla,No.16574);地高辛标记和检测试剂盒:(Boerhinger Mannheim,No1093657);

１　材料与方法　

1.1药物 收稿日期：2003-4-17 作者简介：曾广仙（1965-），男，汉族，中国人民解放军第四五七医黄芪、党参、白术、防风生药饮片由深圳市药院病理科，主治医师；研究方向：临床病理学 2003年 第8卷 第2期 曾广仙等：加味玉屏风散对创伤应激小鼠IL-2与IL-2R基因表达影响的形态计量学研究 95

RPMI-1640：美国Gibco产品、批号31800-022；胎牛血清（FCS）：天津平原试剂公司产品、批号961230；刀豆蛋白A（Con A）：美国Sigma产品、批号C-2010；大肠杆菌(37553)、IL-2RcDNA片断：由第三军医大学提供。 1.3主要仪器

CO2培养箱：美国Forma Scietific产品；低温超速离心机:上海离心机械研究所；图像处理分析仪：同济医大太阳公司产品。 1.4实验动物

BALB/C清洁级小鼠，雌性，体重20±2g，由广州第一军医大学动物中心提供。购回后饲养于同济医科大学动物学部二级动物实验室，自由摄取食水，尽量减少饲养环境变异造成的情绪应激，一周后开始实验。 1.5分组与给药

随机将小鼠分3组：（1）正常对照组；（2）应激对照组：以上两组每鼠每天灌服（PO）蒸馏水0.5ml；（3）应激+160%加味玉屏风散组（应激+HJY组）：每鼠每天灌服（PO）160%加味玉屏风散水煎液0.5ml(含生药0.8g)。以上3组每组10只，均连续灌饲7天。

1.6应激模型的建立[5]

未次用药1～1.5h对（2）和（3）组小鼠右后肢行截肢术，造模时用4号医用缝合线于小鼠右后肢膝关节上端约0.5cm处结扎，然后用手术剪于膝关节处截去右后肢，酒精棉球消毒断端，不包扎。术中及术后基本无出血，术后仍按常规摄取食水，术后无感染及死亡。

1.7小鼠脾细胞的分离、培养与活化

造模后72小时断颈处死小鼠，无菌取出脾脏，用毛玻璃将脾脏磨成细胞悬液，经干净棉花过滤除去杂质。离心收集细胞后用Tris-NH4Cl缓冲液溶解红细胞，用Hanks液洗两遍。将脾细胞悬液于室温放置15分钟，冲洗后用10%FCS-RPMI完全培养液

将细胞调至1×107个细胞/ml。用台盼蓝排斥试验

测细胞存活率在95%以上。加入Con A使其终浓度为5ug/ml，将细胞悬液加入24孔培养板（1ml/孔）中，37℃，5%CO2培养箱，培养至12h收集细胞。 1.8 培养细胞RNA的提取

采用TRIZOL 试剂盒提取RNA，具体方法严格按药盒说明书进行。提取好的RNA用20mlDEPC（焦碳酸二乙酯）处理的双蒸水溶解。置-80℃冰箱备用。

1.9 IL-2质粒的大量制备

严格按质粒提取试剂盒说明从含IL-2cDNA重组质粒的大肠杆菌（37553）中提取和纯化重组质粒DNA。

1.10 IL-2cDNA片段的回收

经0.7%琼脂糖凝胶电泳确定有质粒DNA后，用BamHI进行酶切，最后经电泳回收。具体方法严格按DNA片断提取试剂盒进行。

1.11 IL-2cDNA及IL-2RcDNA地高辛标记

严格按药盒说明书进行。

1.12 IL-2mRNA及IL-2RmRNA的测定（Northern印迹法）

参照文献[6]于致伤后72h进行IL-2mRNA及IL-2RmRNA的定量检测，结果以正常对照组显色强度的百分比（%）表示。

2 统计处理

各组均数间差异作T检验处理。

3 实验结果

应激后第72小时，小鼠脾淋巴细胞中IL-2mRNA及IL-2RmRNA水平分别下降了29%和32%，与正常对照组比较均有非常显著性差异（P值均小于0.01）加味玉屏风散组可明显升高应激小鼠脾淋巴细胞中IL-2mRNA及IL-2RmRNA水平（P<0.01）。

加味玉屏风散对应激小鼠IL-2mRNA及IL-2RmRNA的影响（X±SD） 组别 正常对照组 应激对照组 应激+HJY组

n 10 10 10

IL-2mRNA（%） 100±24 71±13** 97±23＆＆

IL-2RmRNA（%） 100±28 68±18** 102±17＆＆

** 与正常对照组比较P<0.01 ＆＆与应激对照组比较P<0.01

96 中国体视学与图像分析 2003年 第8卷 第2期

4 讨论

严重创伤可致机体的免疫功能受抑,而细胞免疫受抑的程度较体液免疫更为明显[1]。大量的研究证实[7-8] ，创伤后IL-2生成减少，淋巴细胞膜IL-2R表达减少是引发细胞免疫功能低下的中心环节。已知淋巴细胞膜 IL-2R的数目受到细胞内合成及细胞外脱落两方面的影响。合成减少及脱落增加均可导致淋巴细胞膜IL-2R数目的下降。Teodorczyk-Injeyan等[9]观察到创伤病人外周血及淋巴细胞培养上清液中可溶性IL-2R增加，并认为这是由于淋巴细胞膜上IL-2R脱落增加所致。但进一步研究发现，这一变化与创伤后淋巴细胞膜IL-2R表达减少并无明显相关性。提示，创伤后IL-2R的脱落增加是导致淋巴细胞膜IL-2R减少的主要原因。鉴于此，本研究利用核酸分子杂交方法，对创伤后淋巴细胞IL-2mRNA及IL-2RmRNA水平进行检测，发现创伤后72h，小鼠脾淋巴细胞IL-2mRNA及IL-2RmRNA水平低下，表明创伤可致IL-2及IL-2R的基因转录受抑，这一发现为解释创伤后IL-2生成减少，IL-2R表达受抑提供了依据。我们发现加味玉屏风散体内应用对创伤小鼠IL-2mRNA及IL-2RmRNA水平均具有明显的升高作用，提示加味玉屏风散可通过促进创伤小鼠淋巴细胞IL-2及IL-2R的基因转录表达进而逆转IL-2

及IL-2R的抑制状态。这可能是加味玉屏风散纠正创伤后细胞免疫功能低下的作用机理之一。

参考文献

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梁华平，等.国外医学军事医学分册，1991；4：145

陈新，杨路，曾广仙，等.加味玉屏风汤对截肢应激小鼠细胞免疫功能的调节作用.中医杂志,1998,39(8):42 [4]

陈新,杨路,白云. 加味玉屏风汤对截肢应激小鼠巨噬细胞功能的调节作用. 中医研究， 1997, 10(6):16 [5]

杨贵贞，麻彤辉.人参皂甙抗小鼠手术应激的细胞免疫调节效应.中国中西医结合杂志，1998；8（8）：479 [6]

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Teodorczyk-Ingeyan JA,Meritchie DI,petors WJ,et al.Expr-esion and secretion fo IL-2 receptor in trauma patients.Ann Sury 1990;212:202 [9]

Teodorczyk-Ingeyan JA,Sparkes BG,Mills GB et al.Expres-ion and secretion fo IL-2R in trauma patients.Ann Sury 1990;212(2):202

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　我刊名誉主编顾秉林院士就任清华大学校长　

顾秉林， 1970年毕业于清华大学工程物理系并留校工作，1979-82年赴丹麦Aarhus大学学习，1982年获得博士学位。1988-86年赴美国Notre Dame大学作高访学者。1988年任教授，1990年任博士生导师。1993-94年赴日本东北大学任客座教授。

1999年当选为中国科学院院士。2001年3月任清华大学副校长，校学位评定委员会主席，校学科建设领导小组组长。担任国务院学位委员会委员，物理学与天文学学科评议组召集人，教育部物理与天文学教学指导委员会主任委员，中国物理学会常务理事，中国材料学会理事，中国体视学学会代理事长。2003年 4月任清华大学第十七任校长。

顾秉林院士在材料微观结构设计，特别是功能材料的组分、结构与性能关系的研究上作了系统的研究工作：他建立了多元半导体合金设计模型，为某些新材料探索打下了基础；预测了复合钙钛矿材料的基态结构，给出了驰豫铁电体有序-无序的判据；他还揭示了量子点、原子团簇及团簇组装材料的某些新特性。受到国内外专家的高度评价。

　　顾秉林院士长期致力于物理学的研究和高层次人才培养，已发表学术论文220余篇，其中SCI论文200余篇。获得何梁何利基金科技进步奖、国家自然科学奖二等奖、中国高校自然科学奖一等奖、四次教育部（国家教委）科技进步二等奖、北京市科学技术二等奖、宝钢教育基金优秀教师特等奖等多项奖励，曾被国家教委、人事部评为\"优秀回国留学人员\"、被国家人事部评为\"中青年有突出贡献的专家\"。顾秉林院士培养了近20名博士生，其中1名获全国优秀博士学位论文奖，4名获清华大学优秀博士学位论文奖。