第４２卷 第４期 ＶｏＩ．４２ Ｎｏ．４ 河南科技学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ＴｅｃｈｎｏＬｏｇｙ ２０１４年８月 Ａｕｇ．２０１４ ｄｏｔ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８－７５１６．２０１４．０４．００２ 小麦ＳＯＤ基因的电子克隆及生物信息学分析 孙双燕，李东方，张团，张胜利 （河南科技学院，河南新乡４５３００３） 摘要：以ＮＣＢＩ中的ＥＳＴ数据库为主要数据来源，以一系列生物信息学软件为Ｔ具，进行了超氧化物歧化酶 （ＳＯＤ）基因的电子克隆及生物信息学分析．结果表明：通过电子克隆方法获得了ＳＯＤ基因的编码区全长序列．该 预测的ＳＯＤ蛋白质氨基酸序列与数据库中同类基因的蛋白质氨基酸序列具有极高的相似性，并且含有完整的 保守结构域；电子克隆到的ＳＯＤ基因编码的不是分泌蛋白，也不是膜蛋白，而是胞质蛋白．通过某个基因的一个 ＥＳＴ序列采用电子克隆的手段进行基因全长的电子拼接是可行的． 关键词：ＳＯＤ基因；电子克隆；小麦 中图分类号：ｓ５１２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００８—７５１６（２０１４）０４—０００７—０４ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＯＤ ｉｎ ＣＯｍｍｏｎ ｗｈｅａｔ Ｓｕｎ Ｓｈｕａｎｇｙａｎ，Ｌｉ Ｄｏｎｇ￣ｎｇ，Ｚｈａｎｇ Ｔｕａｎ，Ｚｈａｎｇ Ｓｈｅｎｇｌｉ （Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ＥＳＴ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ＮＣＢＩ ａｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｄａｔａ ｓｏｕｒｃｅ，ｗｉｔｈ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｓ ｔｏｏｌｓ，ｔｈｅ ＳＯＤ ｇｅｎｅ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｂｅｅｎ ｄｏｎｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｂｔａｉｎｅｄ ＳＯＤ ｇｅｎｅｓ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎ ｓｉｌｉｅｏ ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＳＯＤ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｓ ａ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｏｆ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ＮＣＢＩ，ａｎｄ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＳＯＤ ｇｅｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｂｙ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｓ ｎｏｔ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｂｕｔ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｇｅｎｅ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｉｓ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｒｅｌａｔｉｖｅ ＥＳＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｋｅｙ ｗＯｒｄｓ：ｓｕｐｅｆｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｇｅｎｅ；ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇ；ｗｈｅａｔ 超氧化物歧化酶（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代 谢过程中产生的过量的超氧自由基类有害物质．ＳＯＤ具有防止小麦细胞膜过氧化功能，在小麦干旱、寒冷、 贫瘠、病害等逆境环境下含量会增加，Ｘ￣／Ｊ＇麦正常生长起保护作用．因此，ＳＯＤ基因的克隆对于小麦ＳＯＤ 相关的逆境抗性机理研究具有重要的理论意义Ｉ ，对小麦分子育种也具有一定的参考价值．研究还发现， ｓ０Ｄ能影响小麦花药的育性【２Ｊ．对于小麦来说，其庞大的基因组（约１７ Ｇ，是人类基因组的５倍多）、异源多 倍体（异源六倍体）使功能基因克隆非常困难．随着高通量二代测序技术的不断成熟与广泛应用，转录组 测序、ＥＳＴ测序等累积了海量的ＤＮＡ序列数据，这为进行基因的电子克隆提供了丰富的ＤＮＡ数据 Ｊ． 本研究以ＮＣＢＩ中的ＥＳＴ数据库为主要数据来源，采用与前人类似的方法进行了小麦ＳＯＤ基因的电子 克隆研究． 收稿日期：２０１４—０６—１６ 基金项目：国家级大学生创新训练项目（２０１３１０４６７０６８） 作者简介：孙双燕（１９９０一），女，河南周口人． 通信作者：张胜利（１９７６一），男，河北鸡泽人，博士，副教授．主要从事植物分子生物学研究 ７ 孙双燕等：小麦ＳＯＤ基因的电子克隆及生物信息学分析 表１ ＳＯＤ基因蛋白序列与ＮＣＢＩ蛋白质数据库ｂｌａｓｔｐ比对结果 Ｔａｂ．１ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｂｌａｓｔｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳＯＤ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ＮＣＢＩ 第４期 注：物种名称前面标Ｐ的表示为预测的蛋白；标Ｈ的表示为假定的蛋白． ２．３ ＳＯＤ预测蛋白的生物信息相关分析 利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ程序对ＳＯＤ预测蛋白进行蛋白质理化性质分析．结果表明：该蛋白的相对分子质量 为２４ ６０１．０ Ｄａ，等电点（ＰＩ）为７．１４；负电荷残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）总数与正电荷残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）相同，均为２４，分 子式为ｃ… Ｈｍ．Ｎ洲Ｏ Ｓ，；在哺乳动物网状细胞（体外）中的半衰期是３０ ｈ；不稳定系数（ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ） 为２８．５９，表明该蛋白比较稳定；平均疏水性（ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）为一０．２６５，表明该蛋白为亲水 蛋白． ＳＯＰＭＡ软件对ＳＯＤ预测蛋白进行的二级结构分析结果表明：该蛋白质含仪螺旋（Ａｌｐｈａ ｈｅｌｉｘ）１０７ 个，占４７．５６％；含 片层（Ｂｅｔａ ｓｈｅｅｔ）３９个，占１７．３３％；含转角（ｔｕｒｎ）１６个，占７．１１％；含卷曲（ｃｏｉｌ）６３个，占 ２８％．应用ＴＭＨＭＭ预测结果表明：本研究电子拼接的ＳＯＤ蛋白不是跨膜蛋白，没有跨膜螺旋．利用 Ｐｈｏｂｉｕｓ、ＳｉｇｎａｌＰ等软件进行信号肽预测，证明该ＳＯＤ蛋白不含有信号肽．上述预测结果暗示，本研究电 子克隆到的ＳＯＤ基因编码的不是分泌蛋白，也不是膜蛋白，而是胞质蛋白． ３讨论 植物基因克隆有多种方法，常用的有图位克隆法、同源序列法、突变体筛选法、差异筛选法等【３ｊ．不同 方法各有其优缺点，在克隆基因时应根据被克隆基因的特点、供体基因组大小、遗传图谱和物理图谱的 完备性等选择使用．由于小麦具有巨大的基因组，对其进行基因克隆及验证相当困难，因此，从事小麦分 子生物学相关研究的学者们都在积极探索小麦基因克隆的快速有效方法．随着新一代高通量测序技术 的不断完善与广泛应用【ｌ２１，包括ＥＳＴ序列在内的基因表达序列数据日益膨胀 １，这为进行基因的电子克 隆提供了十分丰富的数据．前人在电子克隆方面已经做了大量的工作 ，为开展此类研究奠定了坚实的 基础． 与ＲＡＣＥ等其他技术相比，电子克隆具有简便、快速、节省经费等优点，如张德礼等１７ｌ￣ｌＪ用电子克隆 结合实验验证的方法成功克隆了人类新基因Ｃ１７ＯＲＦ２的ｅＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＹ０７４９０７和 ９ ２０１４年 河南科技学院学报（自然科学版） ＢＫＯ００２６０），黄新杰Ｈ利用此法克隆到了３个小麦条锈病相关抗性基因等．本研究采用与前人类似的方法 进行了小麦ＳＯＤ基因的电子克隆，克隆到了ＳＯＤ基因的编码区全长序列，该预测的ＳＯＤ蛋白质氨基酸 序列与数据库中同类基因的蛋白质氨基酸序列具有极高的相似性，并且含有完整的保守结构域，这为 进一步通过实验手段克隆该基因奠定了良好基础，也为探索小麦逆境抗耐性基因快速克隆方法提供了 一定参考． 参考文献： 【１］李娟，杨立新，郑文寅，等＿／Ｊ、麦ＦｅＳＯＤ基因的克隆与序列分析［Ｊ】．核农学报，２０１３，２７（８）：１ １ １ １－１ １ １７． 【２】李莉，张改生，张龙雨，等．小麦生理型与遗传型雄性不育相关基因锰超氧化物歧化酶（Ｍｎ—ＳＯＤ）及果糖１，６一二磷酸醛缩 酶（ＦＢＡ）的表达分析『Ｊ１．农业生物技术学报，２０１２，２０（３）：２２５—２３４． 【３１乔纳森・佩夫斯纳．生物信息学与功能基因组学［ＭＩ．孙之荣，译．北京：化学Ｔ业出版社，２００６． 【４］黄新杰．三个小麦抗条锈病相关基因的全长ｃＤＮＡ克隆及生物信息学分析［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２００７． ［５１ Ｂｏｇｕｓｋｉ Ｍ Ｓ，Ｌｏｗｅ Ｔ Ｍ，Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ Ｃ Ｍ．ｄｈＥＳＴ－ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ“ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ”ｆＪ１．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９３，４（４）：３３２—３３３． 【６１ ｄｂＳＴＳ：ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｇｅｄ Ｓｉｔｅｓ”．［２０１４—０６—１０１．ｈｎｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｂＳＴＳ／． ［７】张德礼 晓静，凌伦奖，等．人类ｓＲ蛋白超家族新成员一ＳＦＲＳＩ２（ＳＲｒｐ５０８）的基因克隆和特性分析［Ｊ１．遗传学报，２００２，２９ （５）：３７７—３８３． 『８］Ａｈｓｃｈｕｌ Ｓ Ｆ，Ｍａｄｄｅｎ Ｔ Ｌ，Ｓｃｈ￣ｉｆｆｅｒ Ａ Ａ，ｅｔ ．Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５：３３８９—３４０２． ｆ９］ＯＲＦ ＦｉｎｄｅｒｆＤＢ／ＯＬ］．［２０１４－０６－１ ｏ１．ｈｔｔｐ：ｆＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍ１． 【１０】ＳＩＢ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔａｌ［ＤＢ／ＯＥ１．［２０１４－０６－１０］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ［１ １】Ｍａｒｃｈｌｅｒ—Ｂａｕｅｒ Ａ，Ｌｕ Ｓ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ Ｂ，ｅｔ ａ１．ＣＤＤ：ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｏｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０ １ ｌ，３９：２２５—２２９． 【１ ２】Ｗｉｃｋｅｒ Ｔ，Ｔａｕｄｉｅｎ Ｓ，Ｈｏｕｂｅｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａ ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｓｎａｐｓｈｏｔ ｏｆ ４５４ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｅｘｐｏｓｅｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｄｅｙ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐａｒａｌｌｅｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｓｉｚｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｂａｒｌｅｙ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００９，５９（５）：７ １ ２—７２２． ［１３】Ｇｕｎａｒａｔｎｅ Ｐ Ｈ，Ｃｏａｒｆａ Ｃ，Ｓｏｉｂａｍ Ｂ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲＮＡ ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ：ｎｅｘｔ－ｇｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，８２２： ２７３－２８８． （责任编辑：邓天福） １０