(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110777154 A(43)申请公布日 2020.02.11
(21)申请号 201910656477.8(22)申请日 2019.07.19
(71)申请人 华大生物科技（武汉）有限公司
地址 430075 湖北省武汉市东湖开发区高
新大道666号武汉国家生物产业基地项目B、C、D区研发楼B2栋
申请人 复旦大学
(72)发明人 李英镇 陈嘉臻 张文宏 吴红龙 (74)专利代理机构 深圳鼎合诚知识产权代理有
限公司 44281
代理人 孙银行 彭家恩(51)Int.Cl.
C12N 15/31(2006.01)C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01)
(54)发明名称
用于结核分枝杆菌耐药检测的突变基因、及其检测方法和试剂盒(57)摘要
本发明公开了结核分枝杆菌的新的耐药基因突变位点，以及结核分枝杆菌的高通量耐药检验方法和试剂盒。本发明用于结核分枝杆菌耐药性检验，有助于缩短患者等待时间、给予患者精准的治疗方案。
C12Q 1/04(2006.01)
权利要求书4页 说明书22页序列表16页 附图1页
CN 110777154 ACN 110777154 A
权 利 要 求 书
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1.一种结核分枝杆菌耐药相关的突变基因，其特征在于，所述突变基因选自如下任一基因的任一突变：
(1)katG基因，其与野生型基因相比存在如下表所示至少一种突变：基因突变名称katGQ88P及M257VkatGW91RkatGA122DkatGQ127PkatGA312EkatGD419Y(2)rpoB基因，其与野生型基因相比存在如下表所示突变：基因突变名称rpoB1291gcc_in(3)gidB基因，其与野生型基因相比存在如下表所示至少一种突变：基因突变名称gidB102g_delgidB386g_ingidB351g_del(4)pncA基因，其与野生型基因相比存在如下表所示至少一种突变：
2.根据权利要求1所述的突变基因，其特征在于，所述katG突变基因的序列如SEQ ID
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权 利 要 求 书
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NO：1～6中的任一序列所示。
3.一种用于结核分枝杆菌耐药检测的方法，其特征在于，所述方法包括检测受试者的结核分枝杆菌是否存在如权利要求1或2所述的突变基因中的突变，如果存在所述突变，则受试者被鉴定为对异烟肼、利福平、链霉素或吡嗪酰胺耐药。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌katG基因或inhA基因与野生型基因相比是否存在如下表所示至少一种突变：
基因突变名称katGS315TkatGS315NinhAc-15t如果存在突变，则受试者被鉴定为对异烟肼耐药；任选地，所述方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌rpoB基因与野生型基因相比是否存在如下表所示至少一种突变：
基因突变名称rpoBS450LrpoBS450FrpoBS450WrpoBH445DrpoBH445LrpoBH445YrpoBD435VrpoBD435GrpoBD435ArpoBL430PrpoBL452P如果存在突变，则受试者被鉴定为对利福平耐药；任选地，所述方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌pncA基因与野生型基因相比是否存在如下表所示至少一种突变：
如果存在突变，则受试者进一步被鉴定为对吡嗪酰胺耐药；任选地，所述方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌gyrA基因与野生型基因相比是否存在如下表所示至少一种突变：
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基因突变名称gyrAA90VgyrAS91PgyrAD94AgyrAD94GgyrAD94HgyrAD94NgyrAD94Y如果存在突变，则受试者进一步被鉴定为对左氧氟沙星耐药；任选地，所述方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌rpsL基因、rrs基因、或gidB基因与野生型基因相比是否存在如下表所示至少一种突变：
基因突变名称rpsLK43RrpsLK88Rrrsa514cgidB移码如果存在突变，则受试者进一步被鉴定为对链霉素耐药；任选地，所述方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌rrs基因与野生型基因相比是否存在如下表所示突变：
基因突变名称rrsa1401g如果存在突变，则受试者进一步被鉴定为对卡那霉素耐药。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述方法包括：(1)对来自受试者的结核分枝杆菌核酸样本进行测序，获得由核酸分子序列构成的测序数据；
(2)对所述测序数据进行基因突变分析，确定所述样本是否存在耐药。6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，对所述测序数据进行基因突变分析，包括：(2-1)对所述测序数据进行过滤；
(2-2)将过滤后的测序数据比对到结核杆菌参考基因组数据库，获得比对上的数据；(2-3)将所述比对上的数据进行碱基质量矫正，获得经矫正的数据；(2-4)将所述经矫正的数据进行基因突变分析，获得基因突变信息；(2-5)基于所述基因突变信息，确定所述样本是否存在耐药；优选地，所述步骤(2-5)，包括：
将所述基因突变信息与耐药基因数据库进行比较，以确定所述基因突变对应的耐受药物，其中所述基因突变为表15中至少一种。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述对来自受试者的结核分枝杆菌核酸样本进行测序，包括：
(1-1)获得所述来自受试者的结核分枝杆菌核酸样本；(1-2)将所述核酸样本进行测序文库构建；
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权 利 要 求 书
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(1-3)对所述测序文库进行高通量测序；任选地，所述测序文库为环状单链测序文库；优选地，所述步骤(1-2)，包括：将所述核酸样本进行片段化，对片段化后的核酸进行末端修改，在经过末端修复的核酸两端连接接头序列，对连接上接头序列的核酸进行PCR扩增，从而获得所述测序文库；
任选地，进一步包括：将PCR扩增后的产物变性为单链，将所述单链进行环化，使用外切酶消化未环化的双链核酸，从而获得环状单链测序文库。
8.一种结核分枝杆菌耐药检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含可扩增如权利要求1或2所述的突变基因的至少一部分的引物对，所述引物对的扩增产物涵盖所述突变基因中的突变位点；
任选地，所述试剂盒进一步包含全基因组打断试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、单链环化试剂、酶切消化试剂中的至少一种。
9.一种结核分枝杆菌耐药检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含与如权利要求1或2所述的突变基因的至少一部分互补的核苷酸序列，所述互补的核苷酸序列涵盖所述突变基因中的突变位点；
任选地，所述核苷酸序列是核酸探针；任选地，所述试剂盒进一步包含全基因组打断试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、探针捕获试剂、单链环化试剂、酶切消化试剂中的至少一种。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒在结核分枝杆菌耐药检测中的用途。
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用于结核分枝杆菌耐药检测的突变基因、及其检测方法和试
剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及生物检验领域，具体涉及结核分枝杆菌的耐药基因突变位点，以及结核分枝杆菌的耐药检验方法。
背景技术
[0002]目前针对结核分枝杆菌的药敏检测方法主要为培养与荧光定量PCR(qPCR)。培养法是将结核分枝菌涂布在培养板上，待结核分枝杆菌铺满整个平板后，在菌板上放置不同剂量的药物。继续培养一段时间后观察药物周围出现菌斑的大小判断细菌耐受程度。该技术需要在有较严格的生物安全实验室进行，同时需要2-3个月的时间才能出结果。qPCR法是将结合分枝杆菌进行核酸提取后，通过特异的引物进行扩增荧光检测核酸序列突变的信息提示细菌的药物耐受性。该方法耗时只需要半天至一天的时间，但目前市面上只有一线的药物相应的检测试剂盒。
[0003]由于培养法耗时长，给病人造成严重的经济负担，同时也耽误了病人的最佳诊疗时间，而荧光定量PCR法通量低，无法检测移码突变或者无突变热点的突变，且覆盖药物的种类少，无法检测二、三线药物。因此，开发一款可用于快速、全面且准确的结核分枝杆菌耐药检测试剂盒，有助于缩短患者等待时间、给予患者精准的治疗方案，具有重要的意义。发明内容
[0004]本申请的发明人基于宏基因组测序技术对结核分枝杆菌进行全基因组测序，分析核酸突变信息后发现了结核分枝杆菌耐药基因的多个新的突变位点。为此，本发明提供了一种快速、全面且准确的结核分枝杆菌耐药检测方法及配套试剂盒，该方法有助于缩短患者等待时间、给予患者精准的治疗方案。[0005]在第一方面，本发明涉及结核分枝杆菌耐药相关的突变基因，该突变基因与其对应的野生型基因相比具有一个或多个有义突变。[0006]有义突变是造成基因功能变化的突变，包括但不限于编码氨基酸序列变化的突变。本发明中，有义突变特别是指使结核分枝杆菌获得或增强对相关药物耐药功能的突变，相关药物特别是指异烟肼、利福平、链霉素或吡嗪酰胺。[0007]在一个实施方案中，本发明的结核分枝杆菌耐药相关的突变基因，选自如下任一基因的任一突变：[0008](1)katG基因，其与野生型基因相比存在如表1所示至少一种突变：[0009]表1 katG基因的突变信息
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[0010]
[0011][0012]
(2)rpoB基因，其与野生型基因相比存在如表2所示突变：表2 rpoB基因的突变信息
[0013]
[0014][0015][0016]
(3)gidB基因，其与野生型基因相比存在如表3所示至少一种突变：表3 gidB基因的突变信息
基因突变名称碱基突变位置碱基突变氨酸突变位置氨基酸突变gidB102g_del102位缺失g34位起移码突变gidB386g_in386位插入g128位起移码突变gidB351g_del351位缺失g117位起移码突变(4)pncA基因，其与野生型基因相比存在如表4所示至少一种突变：表4 pncA基因的突变信息
[0017][0018]
[0019]
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说 明 书
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[0020]
[0021]
在一个实施方案中，上述katG突变基因的序列如SEQ ID NO：1～6中的任一序列所
示。
katG突变基因(Q88P及M257V)的氨基酸序列：
[0023]mpeqhppite tttgaasngc pvvghmkypv egggnqdwwp nrlnlkvlhq npavadpmga afdyaaevat idvdaltrdi eevmttsppw wpadyghygp lfirmawhaa gtyrihdgrg gagggmqrfa plnswpdnas ldkarrllwp vkkkygkkls wadlivfagn calesmgfkt fgfgfgrvdq wepdevywgk eatwlgdery sgkrdlenpl aavqmgliyv npegpngnpd pmaaavdire tfrrmavndv etaalivggh tfgkthgagp adlvgpepea apleqmglgw kssygtgtgk daitsgievv wtntptkwdn sfleilygye weltkspaga wqytakdgag agtipdpfgg pgrsptmlat dlslrvdpiy eritrrwleh peeladefak awyklihrdm gpvarylgpl vpkqtllwqd pvpavshdlv geaeiaslks qirasgltvs qlvstawaaa ssfrgsdkrg ganggrirlq pqvgwevndp dgdlrkvirt leeiqesfns aapgnikvsf adlvvlggca aiekaakaag hnitvpftpg rtdasqeqtd vesfavlepk adgfrnylgk gnplpaeyml ldkanlltls apemtvlvgg lrvlganykr lplgvfteas esltndffvn lldmgitwep spaddgtyqg kdgsgkvkwt gsrvdlvfgs nselralvev ygaddaqpkf vqdfvaawdk vmnldrfdvr(SEQ ID NO：1)。[0024]katG突变基因(W91R)的氨基酸序列：[0025]mpeqhppite tttgaasngc pvvghmkypv egggnqdwwp nrlnlkvlhq npavadpmga afdyaaevat idvdaltrdi eevmttsqpw rpadyghygp lfirmawhaa gtyrihdgrg gagggmqrfa plnswpdnas ldkarrllwp vkkkygkkls wadlivfagn calesmgfkt fgfgfgrvdq wepdevywgk eatwlgdery sgkrdlenpl aavqmgliyv npegpngnpd pmaaavdire tfrrmamndv etaalivggh tfgkthgagp adlvgpepea apleqmglgw kssygtgtgk daitsgievv wtntptkwdn sfleilygye weltkspaga wqytakdgag agtipdpfgg pgrsptmlat dlslrvdpiy eritrrwleh peeladefak awyklihrdm gpvarylgpl vpkqtllwqd pvpavshdlv geaeiaslks qirasgltvs qlvstawaaa ssfrgsdkrg ganggrirlq pqvgwevndp dgdlrkvirt leeiqesfns aapgnikvsf adlvvlggca aiekaakaag hnitvpftpg rtdasqeqtd vesfavlepk adgfrnylgk gnplpaeyml ldkanlltls apemtvlvgg lrvlganykr lplgvfteas esltndffvn lldmgitwep spaddgtyqg kdgsgkvkwt
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[0022]
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gsrvdlvfgs nselralvev ygaddaqpkf vqdfvaawdk vmnldrfdvr(SEQ ID NO：2)。[0026]katG突变基因(A122D)的氨基酸序列：[0027]mpeqhppite tttgaasngc pvvghmkypv egggnqdwwp nrlnlkvlhq npavadpmga afdyaaevat idvdaltrdi eevmttsqpw wpadyghygp lfirmawhaa gtyrihdgrg gdgggmqrfa plnswpdnas ldkarrllwp vkkkygkkls wadlivfagn calesmgfkt fgfgfgrvdq wepdevywgk eatwlgdery sgkrdlenpl aavqmgliyv npegpngnpd pmaaavdire tfrrmamndv etaalivggh tfgkthgagp adlvgpepea apleqmglgw kssygtgtgk daitsgievv wtntptkwdn sfleilygye weltkspaga wqytakdgag agtipdpfgg pgrsptmlat dlslrvdpiy eritrrwleh peeladefak awyklihrdm gpvarylgpl vpkqtllwqd pvpavshdlv geaeiaslks qirasgltvs qlvstawaaa ssfrgsdkrg ganggrirlq pqvgwevndp dgdlrkvirt leeiqesfns aapgnikvsf adlvvlggca aiekaakaag hnitvpftpg rtdasqeqtd vesfavlepk adgfrnylgk gnplpaeyml ldkanlltls apemtvlvgg lrvlganykr lplgvfteas esltndffvn lldmgitwep spaddgtyqg kdgsgkvkwt gsrvdlvfgs nselralvev ygaddaqpkf vqdfvaawdk vmnldrfdvr(SEQ ID NO：3)。[0028]katG突变基因(Q127P)的氨基酸序列：[0029]mpeqhppite tttgaasngc pvvghmkypv egggnqdwwp nrlnlkvlhq npavadpmga afdyaaevat idvdaltrdi eevmttsqpw wpadyghygp lfirmawhaa gtyrihdgrg gagggmprfa plnswpdnas ldkarrllwp vkkkygkkls wadlivfagn calesmgfkt fgfgfgrvdq wepdevywgk eatwlgdery sgkrdlenpl aavqmgliyv npegpngnpd pmaaavdire tfrrmamndv etaalivggh tfgkthgagp adlvgpepea apleqmglgw kssygtgtgk daitsgievv wtntptkwdn sfleilygye weltkspaga wqytakdgag agtipdpfgg pgrsptmlat dlslrvdpiy eritrrwleh peeladefak awyklihrdm gpvarylgpl vpkqtllwqd pvpavshdlv geaeiaslks qirasgltvs qlvstawaaa ssfrgsdkrg ganggrirlq pqvgwevndp dgdlrkvirt leeiqesfns aapgnikvsf adlvvlggca aiekaakaag hnitvpftpg rtdasqeqtd vesfavlepk adgfrnylgk gnplpaeyml ldkanlltls apemtvlvgg lrvlganykr lplgvfteas esltndffvn lldmgitwep spaddgtyqg kdgsgkvkwt gsrvdlvfgs nselralvev ygaddaqpkf vqdfvaawdk vmnldrfdvr(SEQ ID NO：4)。[0030]katG突变基因(A312E)的氨基酸序列：[0031]mpeqhppite tttgaasngc pvvghmkypv egggnqdwwp nrlnlkvlhq npavadpmga afdyaaevat idvdaltrdi eevmttsqpw wpadyghygp lfirmawhaa gtyrihdgrg gagggmqrfa plnswpdnas ldkarrllwp vkkkygkkls wadlivfagn calesmgfkt fgfgfgrvdq wepdevywgk eatwlgdery sgkrdlenpl aavqmgliyv npegpngnpd pmaaavdire tfrrmamndv etaalivggh tfgkthgagp adlvgpepea apleqmglgw kssygtgtgk deitsgievv wtntptkwdn sfleilygye weltkspaga wqytakdgag gtipdpfgg pgrsptmlat dlslrvdpiy eritrrwleh peeladefak awyklihrdm gpvarylgpl vpkqtllwqd pvpavshdlv geaeiaslks qirasgltvs qlvstawaaa ssfrgsdkrg ganggrirlq pqvgwevndp dgdlrkvirt leeiqesfns aapgnikvsf adlvvlggca aiekaakaag hnitvpftpg rtdasqeqtd vesfavlepk adgfrnylgk gnplpaeyml ldkanlltls apemtvlvgg lrvlganykr lplgvfteas esltndffvn lldmgitwep spaddgtyqg kdgsgkvkwt gsrvdlvfgs nselralvev ygaddaqpkf vqdfvaawdk vmnldrfdvr(SEQ ID NO：5)。[0032]katG突变基因(D419Y)的氨基酸序列：[0033]mpeqhppite tttgaasngc pvvghmkypv egggnqdwwp nrlnlkvlhq npavadpmga
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afdyaaevat idvdaltrdi eevmttsqpw wpadyghygp lfirmawhaa gtyrihdgrg gagggmqrfa plnswpdnas ldkarrllwp vkkkygkkls wadlivfagn calesmgfkt fgfgfgrvdq wepdevywgk eatwlgdery sgkrdlenpl aavqmgliyv npegpngnpd pmaaavdire tfrrmamndv etaalivggh tfgkthgagp adlvgpepea apleqmglgw kssygtgtgk daitsgievv wtntptkwdn sfleilygye weltkspaga wqytakdgag agtipdpfgg pgrsptmlat dlslrvdpiy eritrrwleh peeladefak awyklihrym gpvarylgpl vpkqtllwqd pvpavshdlv geaeiaslks qirasgltvs qlvstawaaa ssfrgsdkrg ganggrirlq pqvgwevndp dgdlrkvirt leeiqesfns aapgnikvsf adlvvlggca aiekaakaag hnitvpftpg rtdasqeqtd vesfavlepk adgfrnylgk gnplpaeyml ldkanlltls apemtvlvgg lrvlganykr lplgvfteas esltndffvn lldmgitwep spaddgtyqg kdgsgkvkwt gsrvdlvfgs nselralvev ygaddaqpkf vqdfvaawdk vmnldrfdvr(SEQ ID NO：6)。[0034]上述序列中，带有下划线的氨基酸为突变后的氨基酸。[0035]在第二方面，本发明提供了一种用于结核分枝杆菌耐药检测的方法，该方法包括检测受试者的结核分枝杆菌是否存在如第一方面的突变基因中的突变，如果存在突变，则受试者被鉴定为对异烟肼、利福平、链霉素或吡嗪酰胺耐药。[0036]在一个实施方案中，该方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌katG基因或inhA基因与野生型基因相比是否存在如表5所示至少一种突变：[0037]表5 katG基因与inhA基因的突变信息
[0038]
如果存在突变，则受试者被鉴定为对异烟肼耐药。[0040]在一个实施方案中，该方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌rpoB基因与野生型基因相比是否存在如表6所示至少一种突变：[0041]表6 rpoB基因的突变信息
[0039]
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[0042]
如果存在突变，则受试者被鉴定为对利福平耐药。
[0044]在一个实施方案中，该方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌pncA基因与野生型基因相比是否存在如表7所示至少一种突变：[0045]表7 pncA基因的突变信息
[0043]
[0046]
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[0047]
如果存在突变，则受试者进一步被鉴定为对吡嗪酰胺耐药。
[0049]在一个实施方案中，该方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌gyrA基因与野生型基因相比是否存在如表8所示至少一种突变：[0050]表8 gyrA基因的突变信息
[0048]
[0051]
[0052]
如果存在突变，则受试者进一步被鉴定为对左氧氟沙星耐药。[0053]在一个实施方案中，该方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌rpsL基因、rrs基因、或gidB基因与野生型基因相比是否存在如表9所示至少一种突变：[0054]表9 rpsL基因、rrs基因和gidB基因的突变信息
[0055]
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[0056]
如果存在突变，则受试者进一步被鉴定为对链霉素耐药。
[0058]在一个实施方案中，该方法进一步包括检测受试者的结核分枝杆菌rrs基因与野生型基因相比是否存在如表10所示突变：[0059]表10 rrs基因的突变信息
[0057]
[0060]
如果存在突变，则受试者进一步被鉴定为对卡那霉素耐药。[0062]在一个实施方案中，该方法具体包括：[0063](1)对来自受试者的结核分枝杆菌核酸样本进行测序，获得由核酸分子序列构成的测序数据；[0064](2)对测序数据进行基因突变分析，确定样本是否存在耐药。[0065]在一个实施方案中，对测序数据进行基因突变分析，包括：[0066](2-1)对测序数据进行过滤；[0067](2-2)将过滤后的测序数据比对到结核杆菌参考基因组数据库，获得比对上的数据；[0068](2-3)将比对上的数据进行碱基质量矫正，获得经矫正的数据；[0069](2-4)将经矫正的数据进行基因突变分析，获得基因突变信息；[0070](2-5)基于基因突变信息，确定样本是否存在耐药。[0071]在一个实施方案中，步骤(2-5)，具体包括：[0072]将基因突变信息与耐药基因数据库进行比较，以确定基因突变对应的耐受药物，其中基因突变为表15中至少一种。[0073]在一个实施方案中，对来自受试者的结核分枝杆菌核酸样本进行测序，具体包括：[0074](1-1)获得来自受试者的结核分枝杆菌核酸样本；[0075](1-2)将核酸样本进行测序文库构建；[0076](1-3)对测序文库进行高通量测序；[0077]在另一个实施方案中，测序文库为环状单链测序文库。[0078]在一个实施方案中，步骤(1-2)，包括：[0079]将核酸样本进行片段化，对片段化后的核酸进行末端修改，在经过末端修复的核酸两端连接接头序列，对连接上接头序列的核酸进行PCR扩增，从而获得测序文库。[0080]在另一个实施方案中，进一步包括：将PCR扩增后的产物变性为单链，将单链进行环化，使用外切酶消化未环化的双链核酸，从而获得环状单链测序文库。
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在第三方面，本发明提供了一种结核分枝杆菌耐药检测试剂盒，该试剂盒包含可
扩增本发明第一方面的突变基因至少一部分的引物对，该引物对的扩增产物涵盖该突变基因中的突变位点。
[0082]在一个实施方案中，该试剂盒进一步包含全基因组打断试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、单链环化试剂、酶切消化试剂中的至少一种。[0083]在第四方面，本发明提供了一种结核分枝杆菌耐药检测试剂盒，该试剂盒包含与本发明第一方面的突变基因至少一部分互补的核苷酸序列，该互补序列涵盖该突变基因中的突变位点。
[0084]在一个实施方案中，该核苷酸序列是核酸探针。[0085]在一个实施方案中，该试剂盒进一步包含全基因组打断试剂、末端修复试剂、接头连接试剂、探针捕获试剂、单链环化试剂、酶切消化试剂中的至少一种。[0086]在第五方面，本发明提供了如第三或第四方面的试剂盒在结核分枝杆菌耐药检测中的用途。
[0087]本发明的有益效果如下：[0088](1)提高检测速度：本发明一个检测周期只要3天，显著优于现阶段培养法的2-3个月。[0089](2)提高检测通量：本发明一次能检测6种药物，52种以上的突变，其中有24个突变是首次发现与结核分枝杆菌耐药相关，本发明的检测通量显著高于目前市面的qPCR试剂盒。
附图说明
[0090]图1为本发明一个实施方案中，PCR纯化后产物使用Agilent 2100 Bioanalyzer检测的结果。
具体实施方式
[0091]下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。[0092]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。[0093]本发明发现了一些新的与结核分枝杆菌耐药相关的突变基因。本发明通过如下方法获得这些突变基因及其突变位点：分别采集83个结核病人的痰液，经纯培养后获得83株菌株样本，使用耐药判断标准方法——MIC测定技术，对菌株样品进行耐药试验，如果在MIC检测中发现某个菌株(例如，菌株号No.16-2748)对某种药物(例如，利福平)的耐受浓度异常高，则将这些菌株进行宏基因组测序，以得到全基因组测序数据，找到除了新发现的基因突变位点(例如，rpoB_1291gcc_in)外，无其他与该药物耐药相关的突变位点，即可判断该位点是新的耐药位点。
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基于上述方法，本发明获得的新的突变基因信息如下表11-14所示：表11 KatG基因突变与异烟肼耐药的结果
[0096]
[0097]
表12 rpoB基因突变与利福平耐药的结果
[0098]
[0099]
表13 KatG基因突变与链霉素耐药的结果
[0100]
[0101]
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说 明 书
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表14 pncA基因突变与吡嗪酰胺耐药的结果
[0103]
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[0104]
基于本发明新发现的新突变基因，本发明提出如下技术方案：
[0106](1)耐药基因数据库构建
[0107]本发明根据现有的文献报道的以及上述新发现的耐药信息，构建了针对结核分枝杆菌的利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、链霉素、左氧氟沙星、卡那霉素六种药物的多种突变基因的数据库，如下表15所示，这些突变基因包括新发现的基因突变位点，也包括功能已知的突变位点。
[0108]表15结核分枝杆菌耐药基因数据库
[0105]
[0109]
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[0110]
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[0111]
(2)低起始量文库构建
[0113]由于结核分枝杆菌菌壁较难裂解，提出的核酸有限，所以本发明基于华大智造的测序平台BGISEQ500/MGISEQ2000开发了能适用于低起始量文库构建试剂盒。最低能达到0.5ng的建库起始量，耗时约6个小时。[0114](3)高通量测序
[0115]本发明使用的测序平台为华大自主平台BIGSEQ-500及MGISEQ2000。文库构建及测序的方法和操作流程参照相应试剂盒及仪器使用的操作说明。[0116](4)数据分析如下所示：
[0117]将测序活动的数据按以下流程进行：[0118]1)数据质控：过滤低质量读长(reads)，过滤简单重复reads，过滤含接头的reads。[0119]2)数据库比对：BWA法。[0120]3)GATK重比对：使用GATK的realignment工具重新完成本地比对(local alignment)工作。
[0121]4)碱基质量校正(BQSR)：因为每个碱基的测序得分(Quality scores)对于下游的分析是至关重要的，然后测序结果直接给出的得分却有倾向性，所以必须通过较准的步骤。[0122]5)突变分析及基因分型：SNP和indel分析，经过了上一阶段，得到一个BAM文件。每一个BAM文件都是代表着一个样品，一个样品不应该有多个文件。每一个BAM文件都是经过重新比对(realignment)和重新校正(recalibration)的，并且可能的话是经过压缩的。对于样品，如果测序深度在10X以上的话，推荐的突变分析的域值为Q30，如果小于10X的话，样品多于100可以使用Q4，等于或者小于100使用Q10。[0123]6)结果注释：将步骤5的结果注释到对应的样本中。[0124]以下通过具体实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性
[0112]
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的，不能理解为对本发明保护范围的限制。[0125]实施例1
[0126]经过MIC检测，发现有83株菌株样品对药物耐受浓度异常高。提取这些菌株的核酸样本，进行宏基因组测序。流程如下所示：[0127]1、酶切打断
[0128]1)取出片段化酶(Segmentase)(LC)，震荡混匀5s，瞬时离心后置于冰上待用。Segmentase(LC)的混匀与否关系到打断效果及均一性，请确保充分混匀。[0129]2)根据DNA浓度，取5ng待打断基因组DNA于新的0.2mL PCR管中，体积应≤10μL，不足10μL部分用TE buffer补足。
[0130]3)在冰上配制酶切打断反应液(见下表16)：[0131]表16酶切打断反应液的配制
[0132]
4)用移液器吸取10μL配制好的酶切打断反应液加入步骤2)的PCR管中，涡旋震荡3
次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。[0134]5)将步骤4)PCR管置于PCR仪上，按照表17中的条件进行反应：[0135]表17酶切打断反应条件
[0133]
[0136]
[0137][0138][0139][0140][0141]
6)加入20μL TE缓冲液(Buffer)至总体积40μL。2、末端修复
1)在冰上配制末端修复反应液(见下表18)：表18末端修复反应&添加dA尾反应液的配制
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[0142]
[0143]
2)用移液器吸取10μL配制好的末端修复反应液加入步骤1酶切打断步骤6)的PCR
管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。[0144]3)将步骤2)的PCR管置于PCR仪上，按照表19中的条件进行反应：[0145]表19末端修复反应条件
[0146]
[0147][0148][0149]
4)瞬时离心将反应液收集至管底。3、接头连接1)参照MGIEasy DNA Adapters(10pmol/ul)说明书使用规则，在步骤2末端修复步
骤4)
[0150]
的PCR管中加入5μL对应的MGIEasy DNA Adapters，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离
心将反应液收集至管底。
[0151]2)在冰上配制接头连接反应液(见表20)：[0152]表20接头连接反应液的配制
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[0153]
3)用移液器缓慢吸取25μL配制好的接头连接反应液加入步骤1)的PCR管中，涡旋
震荡6次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。[0155]4)将步骤3)PCR管置于PCR仪上，按照表21中的条件进行反应：[0156]表21接头连接反应条件
[0154]
[0157]
5)瞬时离心将反应液收集至管底。
[0159]6)加入20μL TE Buffer至总体系100μL，全部转移到新的1.5mL EP管中。[0160]4、连接产物纯化
[0161]1)提前30min取出DNA纯化磁珠(Clean Beads)置于室温，使用前充分震荡混匀。[0162]2)用移液器吸取50μL DNA Clean Beads至步骤3接头连接步骤的接头连接产物中，并轻轻吹打至少10次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入EP管中。
[0163]3)室温孵育5min。[0164]4)瞬时离心，将EP管置于磁力架，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。
[0165]5)保持EP管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取并丢弃上清。[0166]6)重复步骤5)，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将EP管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。[0167]7)保持EP管固定于磁力架上，打开EP管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。
[0168]8)将EP管从磁力架上取下，加入21μL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀。
[0169]9)室温下孵育5min。
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[0158]
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10)瞬时离心，将EP管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，将19μL上清液转移
到新的0.2mL PCR管中。[0171]5、PCR扩增
[0172]1)在冰上配制PCR反应液(见表22)：[0173]表22 PCR扩增反应液的配制
[0174]
[0175]
2)用移液器吸取31μL配制好的PCR反应液加入步骤4连接产物纯化步骤10)的PCR管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。[0176]3)将步骤2所述PCR管置于PCR仪上，按照表23的条件进行PCR反应：[0177]表23 PCR扩增反应条件
[0178]
4)瞬时离心将反应液收集至管底。[0180]5)吸取全部反应液转移到新的1.5mL EP管中。[0181]6、PCR产物磁珠片段筛选[0182]1)提前30min取出DNA Clean Beads置于室温，使用前充分震荡混匀。[0183]2)吸取30μL DNA Clean Beads至步骤5PCR扩增步骤5)的50μL PCR产物中，用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入EP管中。
[0184]3)室温孵育5min。[0185]4)瞬时离心，将EP管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。[0186]5)用移液器吸取10μL DNA Clean beads至步骤4)的80μL上清中，轻轻吹打至少10
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[0179]
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次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入EP管中。[0187]6)室温孵育5min。[0188]7)瞬时离心，将EP管置于磁力架，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。
[0189]8)保持EP管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取并丢弃上清。[0190]9)重复步骤8)，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将EP管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。[0191]10)保持EP管固定于磁力架上，打开EP管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。
[0192]11)将EP管从磁力架上取下，加入22μL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀。
[0193]12)室温下孵育5min。[0194]13)瞬时离心，将EP管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，将20μL上清液转移到新的1.5mL EP管中。[0195]7、PCR产物质检
[0196]
1)使用 dsDNA HS Assay Kit荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的操作说
明对PCR磁珠双选纯化后产物进行定量。要求最终PCR产物的摩尔产量≥1pmol，不同片段大小的PCR产物对应的产量参考表24。如需将多个样本混合测序，建议根据MGIEasy DNA接头(Adapters)说明书使用规则设计混合方案，在定量后进行不同接头样本混合，混合后总量为1pmol，总体积≤48μL。
[0197]表24不同片段大小PCR产物1pmol对应产量
[0198]
[0199]
2)通过Tapestation(Agilent Technologies)PCR纯化后产物进行片段分布检测，
如图1所示。[0201]8、变性
[0202]1)根据PCR产物的主片段分布，取1pmol PCR产物至新的0.2mL PCR管中，用TEBuffer补充至总体积48μL。
[0203]2)将步骤1所述PCR管置于PCR仪上，按照表25的条件进行反应：[0204]表25变性反应条件
[0200]
[0205]
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说 明 书
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3)反应结束后，立即将PCR管转移到冰上，静置2min后瞬时离心。9、单链环化
1)在冰上配制单链环化反应液(见表26)：表26单链环化反应液的配制
[0210]
2)用移液器吸取12.1μL配制好的单链环化反应液加入步骤8变性步骤3)的PCR管
中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。[0212]3)将PCR管置于PCR仪上，按照表27的条件进行反应：[0213]表27单链环化反应条件
[0211]
[0214]
[0215][0216][0217][0218]
4)反应结束后，瞬时离心，将PCR管转移到冰上，立即进入下步反应。10、酶切消化
1)在步骤9单链环化步骤3)反应时，提前在冰上配制酶切消化反应液(见表28)：表28酶切消化反应液的配制
[0219]
2)用移液器吸取4μL配制好的酶切消化反应液加入步骤9单链环化步骤4)的PCR管
中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。[0221]3)将步骤2)PCR管置于PCR仪上，按照表29的条件进行反应：[0222]表29酶切消化反应条件
[0220]
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[0223]
4)瞬时离心将反应液收集至管底。
[0225]5)向PCR管中加入3μL 0.5M EDTA，4.5μL无核酸酶的水，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底，吸取全部反应液转移到新的1.5mL EP管中。[0226]11、酶切消化产物纯化[0227]1)提前30min取出DNA Clean Beads置于室温，使用前充分震荡混匀。[0228]2)吸取170μL DNA Clean Beads至步骤10酶切消化步骤5)的71.6μL酶切消化产物中，用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入EP管中。
[0229]3)室温孵育10min。[0230]4)瞬时离心，将EP管置于磁力架，静置2-5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。
[0231]5)保持EP管置于磁力架上，加入500μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取并丢弃上清。[0232]6)重复步骤5)，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将EP管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。[0233]7)保持EP管固定于磁力架上，打开EP管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。
[0234]8)将EP管从磁力架上取下，加入22μL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀。
[0235]9)室温下孵育10min。[0236]10)瞬时离心，将EP管置于磁力架上，静置2-5min至液体澄清，将20μL上清液转移到新的1.5mL EP管中。[0237]12、酶切消化产物质检
[0238]
[0224]
使用 ssDNA Assay Kit荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的操作说明对
酶切消化纯化后产物进行定量。最终产物要求摩尔产量≥80fmol(足够两次上机测序)，可参考表30进行计算。
[0239]表30不同PCR产物片段大小对应80fmol单链环产量
[0240]
[0241][0242]
13、DNA测序反应
使用深圳华大智造科技有限公司生产的“BGISEQ-500RS高通量测序试剂盒
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说 明 书
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(PE100)”或“MGISEQ-2000RS高通量测序试剂盒(PE100)”进行DNA序列分析，严格按照说明书操作。[0243]14、数据分析[0244]1)操作原理
[0245]根据输入信息，生成运行所需程序，对下机数据进行过滤、比对、物种鉴定、变异检测，最后输出所有样品的过滤信息、菌株鉴定信息以及多个基因、位点的耐药变异信息。[0246]2)输入数据
[0247]将下机原始数据导入到服务器中。[0248]3)数据过滤
[0249]使用SOAPnuke软件对拆分数据进行低质量过滤，保留高质量的数据。[0250]4)比对排序
[0251]将步骤3)的高质量数据使用bwa软件比对到参考序列中(H37Rv，GenBank AL123456.3)；使用samtools对比对结果进行排序后使用picard软件对重复序列进行标记；最后使用samtools对排序后的bam文件去除标记的重复序列，输出去冗余的比对结果。[0252]7)变异检测
[0253]将比对的数据使用GATK HaplotypeCaller模块进行变异检测，SelectVariants模块进行变异结果过滤。[0254]8)结果输出
[0255]将本发明所涉及的突变位点信息输出。结果发现，24个新的与结核分枝杆菌耐药相关突变基因，具体突变信息如表11-14所示。
[0256]以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
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序 列 表
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SEQUENCE LISTING<110> 华大生物科技（武汉）有限公司，复旦大学<120> 用于结核分枝杆菌耐药检测的突变基因、及其检测方法和试剂盒<130> 19I28635<160> 6<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 740<212> PRT<213> 结核分枝杆菌<400> 1Met Pro Glu Gln His Pro Pro Ile Thr Glu Thr Thr Thr Gly Ala Ala1 5 10 15Ser Asn Gly Cys Pro Val Val Gly His Met Lys Tyr Pro Val Glu Gly 20 25 30Gly Gly Asn Gln Asp Trp Trp Pro Asn Arg Leu Asn Leu Lys Val Leu 35 40 45His Gln Asn Pro Ala Val Ala Asp Pro Met Gly Ala Ala Phe Asp Tyr 50 55 60Ala Ala Glu Val Ala Thr Ile Asp Val Asp Ala Leu Thr Arg Asp Ile65 70 75 80Glu Glu Val Met Thr Thr Ser Pro Pro Trp Trp Pro Ala Asp Tyr Gly 85 90 95His Tyr Gly Pro Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Ala Ala Gly Thr 100 105 110Tyr Arg Ile His Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Met Gln Arg 115 120 125Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala 130 135 140Arg Arg Leu Leu Trp Pro Val Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser145 150 155 160Trp Ala Asp Leu Ile Val Phe Ala Gly Asn Cys Ala Leu Glu Ser Met 165 170 175Gly Phe Lys Thr Phe Gly Phe Gly Phe Gly Arg Val Asp Gln Trp Glu 180 185 190Pro Asp Glu Val Tyr Trp Gly Lys Glu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Glu 195 200 205Arg Tyr Ser Gly Lys Arg Asp Leu Glu Asn Pro Leu Ala Ala Val Gln
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序 列 表
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210 215 220Met Gly Leu Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asn Gly Asn Pro Asp225 230 235 240Pro Met Ala Ala Ala Val Asp Ile Arg Glu Thr Phe Arg Arg Met Ala 245 250 255Val Asn Asp Val Glu Thr Ala Ala Leu Ile Val Gly Gly His Thr Phe 260 265 270Gly Lys Thr His Gly Ala Gly Pro Ala Asp Leu Val Gly Pro Glu Pro 275 280 285Glu Ala Ala Pro Leu Glu Gln Met Gly Leu Gly Trp Lys Ser Ser Tyr 290 295 300Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Ala Ile Thr Ser Gly Ile Glu Val Val305 310 315 320Trp Thr Asn Thr Pro Thr Lys Trp Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ile Leu 325 330 335Tyr Gly Tyr Glu Trp Glu Leu Thr Lys Ser Pro Ala Gly Ala Trp Gln 340 345 350Tyr Thr Ala Lys Asp Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ile Pro Asp Pro Phe 355 360 365Gly Gly Pro Gly Arg Ser Pro Thr Met Leu Ala Thr Asp Leu Ser Leu 370 375 380Arg Val Asp Pro Ile Tyr Glu Arg Ile Thr Arg Arg Trp Leu Glu His385 390 395 400Pro Glu Glu Leu Ala Asp Glu Phe Ala Lys Ala Trp Tyr Lys Leu Ile 405 410 415His Arg Asp Met Gly Pro Val Ala Arg Tyr Leu Gly Pro Leu Val Pro 420 425 430Lys Gln Thr Leu Leu Trp Gln Asp Pro Val Pro Ala Val Ser His Asp 435 440 445Leu Val Gly Glu Ala Glu Ile Ala Ser Leu Lys Ser Gln Ile Arg Ala 450 455 460Ser Gly Leu Thr Val Ser Gln Leu Val Ser Thr Ala Trp Ala Ala Ala465 470 475 480Ser Ser Phe Arg Gly Ser Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Gly Arg 485 490 495Ile Arg Leu Gln Pro Gln Val Gly Trp Glu Val Asn Asp Pro Asp Gly 500 505 510Asp Leu Arg Lys Val Ile Arg Thr Leu Glu Glu Ile Gln Glu Ser Phe 515 520 525
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序 列 表
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Asn Ser Ala Ala Pro Gly Asn Ile Lys Val Ser Phe Ala Asp Leu Val 530 535 540Val Leu Gly Gly Cys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Ala Lys Ala Ala Gly545 550 555 560His Asn Ile Thr Val Pro Phe Thr Pro Gly Arg Thr Asp Ala Ser Gln 565 570 575Glu Gln Thr Asp Val Glu Ser Phe Ala Val Leu Glu Pro Lys Ala Asp 580 585 590Gly Phe Arg Asn Tyr Leu Gly Lys Gly Asn Pro Leu Pro Ala Glu Tyr 595 600 605Met Leu Leu Asp Lys Ala Asn Leu Leu Thr Leu Ser Ala Pro Glu Met 610 615 620Thr Val Leu Val Gly Gly Leu Arg Val Leu Gly Ala Asn Tyr Lys Arg625 630 635 640Leu Pro Leu Gly Val Phe Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Thr Asn Asp 645 650 655Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Gly Ile Thr Trp Glu Pro Ser Pro 660 665 670Ala Asp Asp Gly Thr Tyr Gln Gly Lys Asp Gly Ser Gly Lys Val Lys 675 680 685Trp Thr Gly Ser Arg Val Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser Glu Leu 690 695 700Arg Ala Leu Val Glu Val Tyr Gly Ala Asp Asp Ala Gln Pro Lys Phe705 710 715 720Val Gln Asp Phe Val Ala Ala Trp Asp Lys Val Met Asn Leu Asp Arg 725 730 735Phe Asp Val Arg 740<210> 2<211> 740<212> PRT<213> 结核分枝杆菌<400> 2Met Pro Glu Gln His Pro Pro Ile Thr Glu Thr Thr Thr Gly Ala Ala1 5 10 15Ser Asn Gly Cys Pro Val Val Gly His Met Lys Tyr Pro Val Glu Gly 20 25 30Gly Gly Asn Gln Asp Trp Trp Pro Asn Arg Leu Asn Leu Lys Val Leu 35 40 45
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His Gln Asn Pro Ala Val Ala Asp Pro Met Gly Ala Ala Phe Asp Tyr 50 55 60Ala Ala Glu Val Ala Thr Ile Asp Val Asp Ala Leu Thr Arg Asp Ile65 70 75 80Glu Glu Val Met Thr Thr Ser Gln Pro Trp Arg Pro Ala Asp Tyr Gly 85 90 95His Tyr Gly Pro Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Ala Ala Gly Thr 100 105 110Tyr Arg Ile His Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Met Gln Arg 115 120 125Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala 130 135 140Arg Arg Leu Leu Trp Pro Val Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser145 150 155 160Trp Ala Asp Leu Ile Val Phe Ala Gly Asn Cys Ala Leu Glu Ser Met 165 170 175Gly Phe Lys Thr Phe Gly Phe Gly Phe Gly Arg Val Asp Gln Trp Glu 180 185 190Pro Asp Glu Val Tyr Trp Gly Lys Glu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Glu 195 200 205Arg Tyr Ser Gly Lys Arg Asp Leu Glu Asn Pro Leu Ala Ala Val Gln 210 215 220Met Gly Leu Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asn Gly Asn Pro Asp225 230 235 240Pro Met Ala Ala Ala Val Asp Ile Arg Glu Thr Phe Arg Arg Met Ala 245 250 255Met Asn Asp Val Glu Thr Ala Ala Leu Ile Val Gly Gly His Thr Phe 260 265 270Gly Lys Thr His Gly Ala Gly Pro Ala Asp Leu Val Gly Pro Glu Pro 275 280 285Glu Ala Ala Pro Leu Glu Gln Met Gly Leu Gly Trp Lys Ser Ser Tyr 290 295 300Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Ala Ile Thr Ser Gly Ile Glu Val Val305 310 315 320Trp Thr Asn Thr Pro Thr Lys Trp Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ile Leu 325 330 335Tyr Gly Tyr Glu Trp Glu Leu Thr Lys Ser Pro Ala Gly Ala Trp Gln 340 345 350Tyr Thr Ala Lys Asp Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ile Pro Asp Pro Phe
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序 列 表
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355 360 365Gly Gly Pro Gly Arg Ser Pro Thr Met Leu Ala Thr Asp Leu Ser Leu 370 375 380Arg Val Asp Pro Ile Tyr Glu Arg Ile Thr Arg Arg Trp Leu Glu His385 390 395 400Pro Glu Glu Leu Ala Asp Glu Phe Ala Lys Ala Trp Tyr Lys Leu Ile 405 410 415His Arg Asp Met Gly Pro Val Ala Arg Tyr Leu Gly Pro Leu Val Pro 420 425 430Lys Gln Thr Leu Leu Trp Gln Asp Pro Val Pro Ala Val Ser His Asp 435 440 445Leu Val Gly Glu Ala Glu Ile Ala Ser Leu Lys Ser Gln Ile Arg Ala 450 455 460Ser Gly Leu Thr Val Ser Gln Leu Val Ser Thr Ala Trp Ala Ala Ala465 470 475 480Ser Ser Phe Arg Gly Ser Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Gly Arg 485 490 495Ile Arg Leu Gln Pro Gln Val Gly Trp Glu Val Asn Asp Pro Asp Gly 500 505 510Asp Leu Arg Lys Val Ile Arg Thr Leu Glu Glu Ile Gln Glu Ser Phe 515 520 525Asn Ser Ala Ala Pro Gly Asn Ile Lys Val Ser Phe Ala Asp Leu Val 530 535 540Val Leu Gly Gly Cys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Ala Lys Ala Ala Gly545 550 555 560His Asn Ile Thr Val Pro Phe Thr Pro Gly Arg Thr Asp Ala Ser Gln 565 570 575Glu Gln Thr Asp Val Glu Ser Phe Ala Val Leu Glu Pro Lys Ala Asp 580 585 590Gly Phe Arg Asn Tyr Leu Gly Lys Gly Asn Pro Leu Pro Ala Glu Tyr 595 600 605Met Leu Leu Asp Lys Ala Asn Leu Leu Thr Leu Ser Ala Pro Glu Met 610 615 620Thr Val Leu Val Gly Gly Leu Arg Val Leu Gly Ala Asn Tyr Lys Arg625 630 635 640Leu Pro Leu Gly Val Phe Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Thr Asn Asp 645 650 655Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Gly Ile Thr Trp Glu Pro Ser Pro 660 665 670
32
CN 110777154 A
序 列 表
6/16页
Ala Asp Asp Gly Thr Tyr Gln Gly Lys Asp Gly Ser Gly Lys Val Lys 675 680 685Trp Thr Gly Ser Arg Val Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser Glu Leu 690 695 700Arg Ala Leu Val Glu Val Tyr Gly Ala Asp Asp Ala Gln Pro Lys Phe705 710 715 720Val Gln Asp Phe Val Ala Ala Trp Asp Lys Val Met Asn Leu Asp Arg 725 730 735Phe Asp Val Arg 740<210> 3<211> 740<212> PRT<213> 结核分枝杆菌<400> 3Met Pro Glu Gln His Pro Pro Ile Thr Glu Thr Thr Thr Gly Ala Ala1 5 10 15Ser Asn Gly Cys Pro Val Val Gly His Met Lys Tyr Pro Val Glu Gly 20 25 30Gly Gly Asn Gln Asp Trp Trp Pro Asn Arg Leu Asn Leu Lys Val Leu 35 40 45His Gln Asn Pro Ala Val Ala Asp Pro Met Gly Ala Ala Phe Asp Tyr 50 55 60Ala Ala Glu Val Ala Thr Ile Asp Val Asp Ala Leu Thr Arg Asp Ile65 70 75 80Glu Glu Val Met Thr Thr Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Tyr Gly 85 90 95His Tyr Gly Pro Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Ala Ala Gly Thr 100 105 110Tyr Arg Ile His Asp Gly Arg Gly Gly Asp Gly Gly Gly Met Gln Arg 115 120 125Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala 130 135 140Arg Arg Leu Leu Trp Pro Val Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser145 150 155 160Trp Ala Asp Leu Ile Val Phe Ala Gly Asn Cys Ala Leu Glu Ser Met 165 170 175Gly Phe Lys Thr Phe Gly Phe Gly Phe Gly Arg Val Asp Gln Trp Glu 180 185 190
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序 列 表
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Pro Asp Glu Val Tyr Trp Gly Lys Glu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Glu 195 200 205Arg Tyr Ser Gly Lys Arg Asp Leu Glu Asn Pro Leu Ala Ala Val Gln 210 215 220Met Gly Leu Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asn Gly Asn Pro Asp225 230 235 240Pro Met Ala Ala Ala Val Asp Ile Arg Glu Thr Phe Arg Arg Met Ala 245 250 255Met Asn Asp Val Glu Thr Ala Ala Leu Ile Val Gly Gly His Thr Phe 260 265 270Gly Lys Thr His Gly Ala Gly Pro Ala Asp Leu Val Gly Pro Glu Pro 275 280 285Glu Ala Ala Pro Leu Glu Gln Met Gly Leu Gly Trp Lys Ser Ser Tyr 290 295 300Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Ala Ile Thr Ser Gly Ile Glu Val Val305 310 315 320Trp Thr Asn Thr Pro Thr Lys Trp Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ile Leu 325 330 335Tyr Gly Tyr Glu Trp Glu Leu Thr Lys Ser Pro Ala Gly Ala Trp Gln 340 345 350Tyr Thr Ala Lys Asp Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ile Pro Asp Pro Phe 355 360 365Gly Gly Pro Gly Arg Ser Pro Thr Met Leu Ala Thr Asp Leu Ser Leu 370 375 380Arg Val Asp Pro Ile Tyr Glu Arg Ile Thr Arg Arg Trp Leu Glu His385 390 395 400Pro Glu Glu Leu Ala Asp Glu Phe Ala Lys Ala Trp Tyr Lys Leu Ile 405 410 415His Arg Asp Met Gly Pro Val Ala Arg Tyr Leu Gly Pro Leu Val Pro 420 425 430Lys Gln Thr Leu Leu Trp Gln Asp Pro Val Pro Ala Val Ser His Asp 435 440 445Leu Val Gly Glu Ala Glu Ile Ala Ser Leu Lys Ser Gln Ile Arg Ala 450 455 460Ser Gly Leu Thr Val Ser Gln Leu Val Ser Thr Ala Trp Ala Ala Ala465 470 475 480Ser Ser Phe Arg Gly Ser Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Gly Arg 485 490 495Ile Arg Leu Gln Pro Gln Val Gly Trp Glu Val Asn Asp Pro Asp Gly
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序 列 表
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500 505 510Asp Leu Arg Lys Val Ile Arg Thr Leu Glu Glu Ile Gln Glu Ser Phe 515 520 525Asn Ser Ala Ala Pro Gly Asn Ile Lys Val Ser Phe Ala Asp Leu Val 530 535 540Val Leu Gly Gly Cys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Ala Lys Ala Ala Gly545 550 555 560His Asn Ile Thr Val Pro Phe Thr Pro Gly Arg Thr Asp Ala Ser Gln 565 570 575Glu Gln Thr Asp Val Glu Ser Phe Ala Val Leu Glu Pro Lys Ala Asp 580 585 590Gly Phe Arg Asn Tyr Leu Gly Lys Gly Asn Pro Leu Pro Ala Glu Tyr 595 600 605Met Leu Leu Asp Lys Ala Asn Leu Leu Thr Leu Ser Ala Pro Glu Met 610 615 620Thr Val Leu Val Gly Gly Leu Arg Val Leu Gly Ala Asn Tyr Lys Arg625 630 635 640Leu Pro Leu Gly Val Phe Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Thr Asn Asp 645 650 655Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Gly Ile Thr Trp Glu Pro Ser Pro 660 665 670Ala Asp Asp Gly Thr Tyr Gln Gly Lys Asp Gly Ser Gly Lys Val Lys 675 680 685Trp Thr Gly Ser Arg Val Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser Glu Leu 690 695 700Arg Ala Leu Val Glu Val Tyr Gly Ala Asp Asp Ala Gln Pro Lys Phe705 710 715 720Val Gln Asp Phe Val Ala Ala Trp Asp Lys Val Met Asn Leu Asp Arg 725 730 735Phe Asp Val Arg 740<210> 4<211> 740<212> PRT<213> 结核分枝杆菌<400> 4Met Pro Glu Gln His Pro Pro Ile Thr Glu Thr Thr Thr Gly Ala Ala1 5 10 15Ser Asn Gly Cys Pro Val Val Gly His Met Lys Tyr Pro Val Glu Gly
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序 列 表
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20 25 30Gly Gly Asn Gln Asp Trp Trp Pro Asn Arg Leu Asn Leu Lys Val Leu 35 40 45His Gln Asn Pro Ala Val Ala Asp Pro Met Gly Ala Ala Phe Asp Tyr 50 55 60Ala Ala Glu Val Ala Thr Ile Asp Val Asp Ala Leu Thr Arg Asp Ile65 70 75 80Glu Glu Val Met Thr Thr Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Tyr Gly 85 90 95His Tyr Gly Pro Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Ala Ala Gly Thr 100 105 110Tyr Arg Ile His Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Met Pro Arg 115 120 125Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala 130 135 140Arg Arg Leu Leu Trp Pro Val Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser145 150 155 160Trp Ala Asp Leu Ile Val Phe Ala Gly Asn Cys Ala Leu Glu Ser Met 165 170 175Gly Phe Lys Thr Phe Gly Phe Gly Phe Gly Arg Val Asp Gln Trp Glu 180 185 190Pro Asp Glu Val Tyr Trp Gly Lys Glu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Glu 195 200 205Arg Tyr Ser Gly Lys Arg Asp Leu Glu Asn Pro Leu Ala Ala Val Gln 210 215 220Met Gly Leu Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asn Gly Asn Pro Asp225 230 235 240Pro Met Ala Ala Ala Val Asp Ile Arg Glu Thr Phe Arg Arg Met Ala 245 250 255Met Asn Asp Val Glu Thr Ala Ala Leu Ile Val Gly Gly His Thr Phe 260 265 270Gly Lys Thr His Gly Ala Gly Pro Ala Asp Leu Val Gly Pro Glu Pro 275 280 285Glu Ala Ala Pro Leu Glu Gln Met Gly Leu Gly Trp Lys Ser Ser Tyr 290 295 300Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Ala Ile Thr Ser Gly Ile Glu Val Val305 310 315 320Trp Thr Asn Thr Pro Thr Lys Trp Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ile Leu 325 330 335
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序 列 表
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Tyr Gly Tyr Glu Trp Glu Leu Thr Lys Ser Pro Ala Gly Ala Trp Gln 340 345 350Tyr Thr Ala Lys Asp Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ile Pro Asp Pro Phe 355 360 365Gly Gly Pro Gly Arg Ser Pro Thr Met Leu Ala Thr Asp Leu Ser Leu 370 375 380Arg Val Asp Pro Ile Tyr Glu Arg Ile Thr Arg Arg Trp Leu Glu His385 390 395 400Pro Glu Glu Leu Ala Asp Glu Phe Ala Lys Ala Trp Tyr Lys Leu Ile 405 410 415His Arg Asp Met Gly Pro Val Ala Arg Tyr Leu Gly Pro Leu Val Pro 420 425 430Lys Gln Thr Leu Leu Trp Gln Asp Pro Val Pro Ala Val Ser His Asp 435 440 445Leu Val Gly Glu Ala Glu Ile Ala Ser Leu Lys Ser Gln Ile Arg Ala 450 455 460Ser Gly Leu Thr Val Ser Gln Leu Val Ser Thr Ala Trp Ala Ala Ala465 470 475 480Ser Ser Phe Arg Gly Ser Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Gly Arg 485 490 495Ile Arg Leu Gln Pro Gln Val Gly Trp Glu Val Asn Asp Pro Asp Gly 500 505 510Asp Leu Arg Lys Val Ile Arg Thr Leu Glu Glu Ile Gln Glu Ser Phe 515 520 525Asn Ser Ala Ala Pro Gly Asn Ile Lys Val Ser Phe Ala Asp Leu Val 530 535 540Val Leu Gly Gly Cys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Ala Lys Ala Ala Gly545 550 555 560His Asn Ile Thr Val Pro Phe Thr Pro Gly Arg Thr Asp Ala Ser Gln 565 570 575Glu Gln Thr Asp Val Glu Ser Phe Ala Val Leu Glu Pro Lys Ala Asp 580 585 590Gly Phe Arg Asn Tyr Leu Gly Lys Gly Asn Pro Leu Pro Ala Glu Tyr 595 600 605Met Leu Leu Asp Lys Ala Asn Leu Leu Thr Leu Ser Ala Pro Glu Met 610 615 620Thr Val Leu Val Gly Gly Leu Arg Val Leu Gly Ala Asn Tyr Lys Arg625 630 635 640Leu Pro Leu Gly Val Phe Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Thr Asn Asp
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序 列 表
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645 650 655Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Gly Ile Thr Trp Glu Pro Ser Pro 660 665 670Ala Asp Asp Gly Thr Tyr Gln Gly Lys Asp Gly Ser Gly Lys Val Lys 675 680 685Trp Thr Gly Ser Arg Val Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser Glu Leu 690 695 700Arg Ala Leu Val Glu Val Tyr Gly Ala Asp Asp Ala Gln Pro Lys Phe705 710 715 720Val Gln Asp Phe Val Ala Ala Trp Asp Lys Val Met Asn Leu Asp Arg 725 730 735Phe Asp Val Arg 740<210> 5<211> 739<212> PRT<213> 结核分枝杆菌<400> 5Met Pro Glu Gln His Pro Pro Ile Thr Glu Thr Thr Thr Gly Ala Ala1 5 10 15Ser Asn Gly Cys Pro Val Val Gly His Met Lys Tyr Pro Val Glu Gly 20 25 30Gly Gly Asn Gln Asp Trp Trp Pro Asn Arg Leu Asn Leu Lys Val Leu 35 40 45His Gln Asn Pro Ala Val Ala Asp Pro Met Gly Ala Ala Phe Asp Tyr 50 55 60Ala Ala Glu Val Ala Thr Ile Asp Val Asp Ala Leu Thr Arg Asp Ile65 70 75 80Glu Glu Val Met Thr Thr Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Tyr Gly 85 90 95His Tyr Gly Pro Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Ala Ala Gly Thr 100 105 110Tyr Arg Ile His Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Met Gln Arg 115 120 125Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala 130 135 140Arg Arg Leu Leu Trp Pro Val Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser145 150 155 160Trp Ala Asp Leu Ile Val Phe Ala Gly Asn Cys Ala Leu Glu Ser Met
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序 列 表
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165 170 175Gly Phe Lys Thr Phe Gly Phe Gly Phe Gly Arg Val Asp Gln Trp Glu 180 185 190Pro Asp Glu Val Tyr Trp Gly Lys Glu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Glu 195 200 205Arg Tyr Ser Gly Lys Arg Asp Leu Glu Asn Pro Leu Ala Ala Val Gln 210 215 220Met Gly Leu Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asn Gly Asn Pro Asp225 230 235 240Pro Met Ala Ala Ala Val Asp Ile Arg Glu Thr Phe Arg Arg Met Ala 245 250 255Met Asn Asp Val Glu Thr Ala Ala Leu Ile Val Gly Gly His Thr Phe 260 265 270Gly Lys Thr His Gly Ala Gly Pro Ala Asp Leu Val Gly Pro Glu Pro 275 280 285Glu Ala Ala Pro Leu Glu Gln Met Gly Leu Gly Trp Lys Ser Ser Tyr 290 295 300Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Glu Ile Thr Ser Gly Ile Glu Val Val305 310 315 320Trp Thr Asn Thr Pro Thr Lys Trp Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ile Leu 325 330 335Tyr Gly Tyr Glu Trp Glu Leu Thr Lys Ser Pro Ala Gly Ala Trp Gln 340 345 350Tyr Thr Ala Lys Asp Gly Ala Gly Gly Thr Ile Pro Asp Pro Phe Gly 355 360 365Gly Pro Gly Arg Ser Pro Thr Met Leu Ala Thr Asp Leu Ser Leu Arg 370 375 380Val Asp Pro Ile Tyr Glu Arg Ile Thr Arg Arg Trp Leu Glu His Pro385 390 395 400Glu Glu Leu Ala Asp Glu Phe Ala Lys Ala Trp Tyr Lys Leu Ile His 405 410 415Arg Asp Met Gly Pro Val Ala Arg Tyr Leu Gly Pro Leu Val Pro Lys 420 425 430Gln Thr Leu Leu Trp Gln Asp Pro Val Pro Ala Val Ser His Asp Leu 435 440 445Val Gly Glu Ala Glu Ile Ala Ser Leu Lys Ser Gln Ile Arg Ala Ser 450 455 460Gly Leu Thr Val Ser Gln Leu Val Ser Thr Ala Trp Ala Ala Ala Ser465 470 475 480
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序 列 表
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Ser Phe Arg Gly Ser Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Gly Arg Ile 485 490 495Arg Leu Gln Pro Gln Val Gly Trp Glu Val Asn Asp Pro Asp Gly Asp 500 505 510Leu Arg Lys Val Ile Arg Thr Leu Glu Glu Ile Gln Glu Ser Phe Asn 515 520 525Ser Ala Ala Pro Gly Asn Ile Lys Val Ser Phe Ala Asp Leu Val Val 530 535 540Leu Gly Gly Cys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Ala Lys Ala Ala Gly His545 550 555 560Asn Ile Thr Val Pro Phe Thr Pro Gly Arg Thr Asp Ala Ser Gln Glu 565 570 575Gln Thr Asp Val Glu Ser Phe Ala Val Leu Glu Pro Lys Ala Asp Gly 580 585 590Phe Arg Asn Tyr Leu Gly Lys Gly Asn Pro Leu Pro Ala Glu Tyr Met 595 600 605Leu Leu Asp Lys Ala Asn Leu Leu Thr Leu Ser Ala Pro Glu Met Thr 610 615 620Val Leu Val Gly Gly Leu Arg Val Leu Gly Ala Asn Tyr Lys Arg Leu625 630 635 640Pro Leu Gly Val Phe Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Thr Asn Asp Phe 645 650 655Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Gly Ile Thr Trp Glu Pro Ser Pro Ala 660 665 670Asp Asp Gly Thr Tyr Gln Gly Lys Asp Gly Ser Gly Lys Val Lys Trp 675 680 685Thr Gly Ser Arg Val Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser Glu Leu Arg 690 695 700Ala Leu Val Glu Val Tyr Gly Ala Asp Asp Ala Gln Pro Lys Phe Val705 710 715 720Gln Asp Phe Val Ala Ala Trp Asp Lys Val Met Asn Leu Asp Arg Phe 725 730 735Asp Val Arg<210> 6<211> 740<212> PRT<213> 结核分枝杆菌<400> 6Met Pro Glu Gln His Pro Pro Ile Thr Glu Thr Thr Thr Gly Ala Ala
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序 列 表
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1 5 10 15Ser Asn Gly Cys Pro Val Val Gly His Met Lys Tyr Pro Val Glu Gly 20 25 30Gly Gly Asn Gln Asp Trp Trp Pro Asn Arg Leu Asn Leu Lys Val Leu 35 40 45His Gln Asn Pro Ala Val Ala Asp Pro Met Gly Ala Ala Phe Asp Tyr 50 55 60Ala Ala Glu Val Ala Thr Ile Asp Val Asp Ala Leu Thr Arg Asp Ile65 70 75 80Glu Glu Val Met Thr Thr Ser Gln Pro Trp Trp Pro Ala Asp Tyr Gly 85 90 95His Tyr Gly Pro Leu Phe Ile Arg Met Ala Trp His Ala Ala Gly Thr 100 105 110Tyr Arg Ile His Asp Gly Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Met Gln Arg 115 120 125Phe Ala Pro Leu Asn Ser Trp Pro Asp Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ala 130 135 140Arg Arg Leu Leu Trp Pro Val Lys Lys Lys Tyr Gly Lys Lys Leu Ser145 150 155 160Trp Ala Asp Leu Ile Val Phe Ala Gly Asn Cys Ala Leu Glu Ser Met 165 170 175Gly Phe Lys Thr Phe Gly Phe Gly Phe Gly Arg Val Asp Gln Trp Glu 180 185 190Pro Asp Glu Val Tyr Trp Gly Lys Glu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Glu 195 200 205Arg Tyr Ser Gly Lys Arg Asp Leu Glu Asn Pro Leu Ala Ala Val Gln 210 215 220Met Gly Leu Ile Tyr Val Asn Pro Glu Gly Pro Asn Gly Asn Pro Asp225 230 235 240Pro Met Ala Ala Ala Val Asp Ile Arg Glu Thr Phe Arg Arg Met Ala 245 250 255Met Asn Asp Val Glu Thr Ala Ala Leu Ile Val Gly Gly His Thr Phe 260 265 270Gly Lys Thr His Gly Ala Gly Pro Ala Asp Leu Val Gly Pro Glu Pro 275 280 285Glu Ala Ala Pro Leu Glu Gln Met Gly Leu Gly Trp Lys Ser Ser Tyr 290 295 300Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asp Ala Ile Thr Ser Gly Ile Glu Val Val305 310 315 320
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序 列 表
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Trp Thr Asn Thr Pro Thr Lys Trp Asp Asn Ser Phe Leu Glu Ile Leu 325 330 335Tyr Gly Tyr Glu Trp Glu Leu Thr Lys Ser Pro Ala Gly Ala Trp Gln 340 345 350Tyr Thr Ala Lys Asp Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ile Pro Asp Pro Phe 355 360 365Gly Gly Pro Gly Arg Ser Pro Thr Met Leu Ala Thr Asp Leu Ser Leu 370 375 380Arg Val Asp Pro Ile Tyr Glu Arg Ile Thr Arg Arg Trp Leu Glu His385 390 395 400Pro Glu Glu Leu Ala Asp Glu Phe Ala Lys Ala Trp Tyr Lys Leu Ile 405 410 415His Arg Tyr Met Gly Pro Val Ala Arg Tyr Leu Gly Pro Leu Val Pro 420 425 430Lys Gln Thr Leu Leu Trp Gln Asp Pro Val Pro Ala Val Ser His Asp 435 440 445Leu Val Gly Glu Ala Glu Ile Ala Ser Leu Lys Ser Gln Ile Arg Ala 450 455 460Ser Gly Leu Thr Val Ser Gln Leu Val Ser Thr Ala Trp Ala Ala Ala465 470 475 480Ser Ser Phe Arg Gly Ser Asp Lys Arg Gly Gly Ala Asn Gly Gly Arg 485 490 495Ile Arg Leu Gln Pro Gln Val Gly Trp Glu Val Asn Asp Pro Asp Gly 500 505 510Asp Leu Arg Lys Val Ile Arg Thr Leu Glu Glu Ile Gln Glu Ser Phe 515 520 525Asn Ser Ala Ala Pro Gly Asn Ile Lys Val Ser Phe Ala Asp Leu Val 530 535 540Val Leu Gly Gly Cys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Ala Lys Ala Ala Gly545 550 555 560His Asn Ile Thr Val Pro Phe Thr Pro Gly Arg Thr Asp Ala Ser Gln 565 570 575Glu Gln Thr Asp Val Glu Ser Phe Ala Val Leu Glu Pro Lys Ala Asp 580 585 590Gly Phe Arg Asn Tyr Leu Gly Lys Gly Asn Pro Leu Pro Ala Glu Tyr 595 600 605Met Leu Leu Asp Lys Ala Asn Leu Leu Thr Leu Ser Ala Pro Glu Met 610 615 620Thr Val Leu Val Gly Gly Leu Arg Val Leu Gly Ala Asn Tyr Lys Arg
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序 列 表
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625 630 635 640Leu Pro Leu Gly Val Phe Thr Glu Ala Ser Glu Ser Leu Thr Asn Asp 645 650 655Phe Phe Val Asn Leu Leu Asp Met Gly Ile Thr Trp Glu Pro Ser Pro 660 665 670Ala Asp Asp Gly Thr Tyr Gln Gly Lys Asp Gly Ser Gly Lys Val Lys 675 680 685Trp Thr Gly Ser Arg Val Asp Leu Val Phe Gly Ser Asn Ser Glu Leu 690 695 700Arg Ala Leu Val Glu Val Tyr Gly Ala Asp Asp Ala Gln Pro Lys Phe705 710 715 720Val Gln Asp Phe Val Ala Ala Trp Asp Lys Val Met Asn Leu Asp Arg 725 730 735Phe Asp Val Arg 740
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说 明 书 附 图
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图1
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