！璺 壁塑 垫 ！笙 塑 ： 笙 ！塑 ： 二 垒 里苎！呈 ！：！ ！： ＤＯＩ：１０．１３７４６４．ｎｊｋｊ．２０１５３８５ 清香型小曲白酒产酯酵母的筛选及应用 杨 强，唐 洁，杨生智，夏金阳，王 拮，刘源才 （劲牌有限公司，湖北大冶４３５１００） 摘要：从酒曲中分离的多株酵母，通过液态发酵初筛、小试固态发酵复筛获得高产乙酸乙酯酵母。将产酯酵母 应用于生产中。研究其对清香型小曲白酒发酵的影响。采用高粱汁液态发酵，结合风味物质初筛出７株产乙酸乙 酯性能较好的酵母菌株。在实验室模拟小曲白酒生产工艺搭建小试固态发酵平台，通过对７株酵母小试固态发酵 复筛，测定发酵结束后蒸馏液中乙酸乙酯含量，获得４株高产乙酸乙酯产酯酵母，均比对照组提高了近４倍以上。 并将复筛获得的３株酵母扩大培养制备成酵母麸皮种，按比例添加至公司酒曲中，应用于中试车间生产，与对照酒 曲（不添加产酯酵母）相比，出酒率均未受添加产酯酵母影响而下降。其中，添加Ｙ２９和Ｙ４２ ２株酵母产酒中乙酸 乙酯含量分别为２．００４ ｇ／Ｌ、１．５２３ ｇ／Ｌ，比对照组提高了９９．４％和５１．５％，正丙醇含量分别下降４４－２％和４２．７％，而 Ｙ２９高级醇含量提高了１６．５％，其他色谱指标无明显差别。 关键词： 产酯酵母； 乙酸乙酯； 清香型小曲白酒； 酒质酒率； 酿酒生产 中图分类号：ＴＳ２６１．１；ＴＳ２６２＿３；ＴＳ２６１．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１—９２８６｛２０１６）０１—００７８—０３ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｔｅｒ。－。ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｙｅａｓｔ Ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｉｎｇｘｉａｎｇ Ｘｉａｏｑｕ Ｂａｉｊｉｕ ＹＡＮＧ Ｑｉａｎｇ，Ｔ Ｇ Ｊｉｅ，ＹＡＮＧ Ｓｈｅｎｇｚｈｉ，ＸＩＡ Ｊｉｎｙａｎｇ，Ⅵ ＮＧ Ｚｈｅ ａｎｄ ＬＩＵ Ｙｕａｎｃａｉ （Ｊｉｎｇｐａｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｄａｙｅ，Ｈｕｂｅｉ ４３５１００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｉｑｕｏｒ ｓｔａｒｔｅＬ ７ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｈ ｇｏｏｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｙｉｅｌｄ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１ｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｒｇｈｕｍ ｊｕｉｃｅ）ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｈ ｆｔｌａｖｏｒｉｎｇ ｃｏｍ— ｐｏｕｎｄｓ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ｔｈｅｎ ａｆｔｅｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｂｙ ｓｍａｌｌ—ｓｃａｌｅ ｓｏｌｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，４ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｙｉｅｌｄ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｗｅｒｅ ｆｉｎａｌｌｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｂｙ ｔｈｏｓｅ ４ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ａｌｍｏｓｔ ４ ｔｉｍｅｓ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅｎ ３ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｓ ｙｅａｓｔ ｂｒａｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ａｄｄｅｄ ｉｎ ｌｉｑｕｏｒ ｓｔａｒｔｅｒ ｆｏｒ ｍｅｄｉｕｍ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｃｃｏｒｄ— ｉｎｇ ｔｏ ｃｅｒｔａｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｌｉｑｕｏｒ ｓｔａｒｔｅｒ，ｌｉｑｕｏｒ ｙｉｅｌｄ ｄｉｄ ｎｏｔ ｄｅｃｒｅａｓｅ，ａｎｄ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｌｉ— ｑｕｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ９９％ｔｏ ２．００４ ｇｍ ｆｏｒ Ｙ２９ ａｎｄ ｂｙ ５ １．５％ｔｏ １．５２３ ｇ／Ｌ ｆｏｒ Ｙ４２ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，Ｎ－ｐｒｏｐａｎｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ４４．２％ａｎｄ ４２．７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅ ｈｉｇｈｅｒ ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １ ６．５％ｆｏｒ Ｙ２９．ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ— ｉｃｄａｔａ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｓｔｅｒ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ；ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ；Ｑｉｎｇｘｉａｎｇ Ｘｉａｏｑｕ Ｂａｉｊｉｕ；ｌｉｑｕｏｒ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｌｉｑｕｏｒ ｑｕａｌｉｔｙ；ｌｉｑｕｏｒ－ｍａｋｉｎｇ 酯类作为呈香物质，在白酒的香气形成中具有极其 提高小曲白酒质量，从而提升产品竞争力。同时，可以解 重要的作用，是区别于其他蒸馏酒的主要特征之一。乙 决困扰小曲白酒行业所产原酒中酯含量低的难题，促进 酸乙酯是小曲白酒中重要的风味化合物，是清香型小曲 行业的发展，对小曲白酒传统技术的改造和提升都有着 白酒的特征香味成分之一。乙酸乙酯在酯类物质中处于 积极的现实意义。 主导地位，其含量高低很大程度决定着清香型白酒的质 量及风格。在小曲原酒中，乙酸乙酯含量高的酒香味好， １材料与方法 １．１材料 提高乙酸乙酯含量有利于提高原酒质量。与大曲酒相 比，清香型小曲原酒中的酯含量较低，具有较大的提升空 间。通过进一步提高小曲原酒中乙酸乙酯含量，有利于 收稿日期：２０１５—０９—２２ １．１．１酵母菌株 从实验室收集酒曲、酒醅中分离得到。 作者简介：杨强，男，湖北浠水人，硕士，总工程师，中酒协、中食协白酒国家评委。 通讯作者：刘源才，男，博士，劲牌有限公司技术总监，主要从事保健酒研发和天然提取物方面的研究。 优先数字出版时间：２０１５—１１－０４；地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／５２．１０５１．ＴＳ．２０１５１１０４．１ｌ１０．０１０．ｈｔｍｌ。 杨强，唐洁，杨生智，夏金阳，王拮，刘源才·清香型小曲白酒产酯酵母的筛选及应用 ７９ １．１．２培养基 是酿酒酵母，主要完成酒精发酵，具有较高的发酵速率和 ＷＬ培养基：酵母浸粉０．４％，蛋白胨０．５％，葡萄糖 完全的发酵能力。另一类是非酿酒酵母，虽然其发酵效 ５％，磷酸二氢钾０．０５５％，氯化钾０．０４２５％，氯化钙 率较低，但能够合成多种酶，将原料中的前体物质转换成 ０．０１２５％，氯化铁０．０００２５％，硫酸镁０．０１２５％，硫酸锰 风味物质如酯、酸、高级醇和醛等产物，影响酒的感官品 ０．０００２５％，溴甲酚绿０．００２２％，琼脂２％，ｐＨ６．５，１２１℃ 质。通过考察不同酵母菌对糖的利用率及ＣＯ：失重情况 灭菌２０ ｍｉｎ。 可判断该菌株发酵性能的优劣，考察酵母菌株产乙酸乙 酯含量鉴别菌株是否为产酯酵母。 表１各种属酵母发酵能力比较 ＹＰＤ培养基：２％葡萄糖，２％蛋白胨，１％酵母膏， ２％琼脂，１２１℃灭菌２０ ｍｉｎ。 液体ＹＥＰＤ培养基：葡萄糖２％，酵母膏１％，蛋白胨 ２％。 高梁汁培养基：高粱：水＝ｌ：４，然后水浴糖化，过滤， 稀释到１０。Ｂｘ。 １．２实验方法 １．２．１酵母菌株的分离纯化 称取１０ ｇ酒醅于９０ ｍＬ无菌生理盐水的三角瓶中 （装有玻璃珠），２００ ｒ／ｍｉｎ振荡浸提３０ ｍｉｎ，吸取上清液， 稀释到合适浓度，一般稀释３个浓度梯度，取２００ Ｌ涂 布，所有平板作３次重复。３０℃培养５ ｄ后，利用酵母在 ＷＬ培养基的不同形态特征进行初步分类。待长出菌落 捞榜一一 ．。 ｕ Ｏ ９ ２ ３ 怊 ４ ５ 后，选择具有典型酵母菌菌落特征的单菌落进一步划线 分离２～３次，经镜检为纯种后分别转入ＹＰＤ固体斜面， ∞加∞。 盯∞踮盯叭踟 低温保存。 煺 一一１．２．２液态发酵初筛 将分离纯化后的酵母以相同的接种量（酵母数量为 糖 一一 ∞∞咖 腼 ２册ｏ＆＆ ｍ ∞的ｍ ＂墙ｌＸ１０ ｃｆｕ／ｍＬ）分别接入装有５０ ｍＬ的高粱汁培养液中， 然后装发酵栓并称重，置于３０℃培养箱中恒温培养，每 隔２４ ｈ振荡并称重，记录失重量，当失重量小于０．２ ｇ时， 停止培养。发酵结束后，测发酵液理化指标及风味物质 ～酯酸唱乙 一一 一一Ｌ 一如Ｌ 弱一一船＆一 一一 一一 一 含量。 １．２．３小试固态发酵复筛 实验室模拟小曲白酒生产工艺搭建小试固态发酵平 台，具体工艺流程：泡粮、初蒸、焖粮、复蒸、撒曲、糖化、发 酵，其中蒸粮结束后要求粮食开口好，完全透心，一致性 好，水分在５５％左右。发酵７ ｄ结束后，固态蒸馏，馏液 经ＧＣ测乙酸乙酯含量。 １．２．４生产应用 酵母通过试管种、摇瓶培养、发酵罐培养至种曲机扩 大培养制备成酵母麸皮种，再按比例添至酒曲中作为酒 曲应用于中试车间进行发酵，出酒后经ＧＣ测挥发性风 味物质，并进行感官品评。 ２结果与讨论 ２．１液态初筛结果 根据酵母的作用，大致可将酵母分成两大类。一类 ８ ％ Ｈ ９ ０ １ ２ ３ ４ ５ ¨ Ｈ¨Ｈ ６ ７ ８ ９ Ｏ ３ ４ ５ 明明∞ ｎ 。Ｌ 船弘们弘｝。。２ 韶 均叭 眦 加 印 瑚ｏ∞０ 珊瑚瑚ｍ＂＆ ＆０ ０ ｏ％。 ¨ 一一 一一 注：“一”为未检出。一 一一 一４Ｍ 一＂一一一 一＆罟吕 曩 一一一一明一一Ｍ一 一 一 一 从表１可看出，Ｙ３２、Ｙ３３ ２株酵母产气较强，且残糖 也较低，代谢产乙酸乙酯含量低，说明该２株酵母对糖利 用率较高、发酵性能好，并不是产酯酵母；Ｙ４２产乙酸乙 酯能力最强，发酵液中乙酸乙酯含量为１．０４ ｇ／Ｌ，其次是 Ｙ４６，乙酸乙酯含量为Ｏ．８９ ｇ／Ｌ。此外，Ｙ６、Ｙ４、Ｙ２９、Ｙ１０ 和Ｙ９产酯性能也较好。可判定此７株酵母为产酯酵母， 且除Ｙ４６外，其余６株酵母也具有一定的发酵能力。 ２．２小试固态发酵复筛 将液态发酵初筛产酯性能较好的７株酵母制备成麸 皮二级种，再按比例配成酒曲，对照曲为不添加产酯酵母 的酒曲。经过泡粮、蒸粮、焖粮、糖化、发酵、蒸馏，发酵结 束后蒸酒，酒样色谱结果中乙酸乙酯含量见表２。乙酸 乙酯含量取平均值见图ｌ。 根据色谱结果分析，与对照相比，Ｙ４、Ｙ６和Ｙ９ ３株酵母 在小试固态发酵产酒中乙酸乙酯含量与对照组相当，提高不 明显。Ｙ４２产乙酸乙酯含量最高，平均为２７１．０１ １００ ｇ醅， ６ 。。一 ８０ 酿酒科技２０１６年第１期（总第２５９期）‘ＬＩＱＵＯＲ—ＭＡＫＩＮＧ ＳＣＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２０１６ Ｎｏ．１（Ｔｏ１．２５９） （ｇ／｜００ ｇ酷） 一 表２酵母菌的产酯情况 斛 艇 一锰∞。。Ｉ／８）咖钟哿ｆＺ甾ＴＺ Ｏ ∞ Ｏ Ｏ Ｏ Ｏ ｍ Ｏ ０ 号ｊ 图２不同酵母应用于中试车间酒质酒率情况 以添加Ｙ２９的乙酸乙酯含量最高，为２．００４ｇ／Ｌ，比对照组 Ｙ４ Ｙ６ Ｙ９ Ｙ１０ Ｙ２９ Ｙ４２ Ｙ４６对照曲 图１酵母菌的产酯情况 其次为Ｙ４６，乙酸乙酯含量为２５５．１３ ｇ／１００ ｇ醅，这与液态 发酵该２株酵母产酯一致。此外，Ｙ１０、Ｙ２９ ２株酵母代 谢产乙酸乙酯能力也较好，４株酵母产酯性能均比对照 组提高了近４倍以上。 ２＿３ 中试车间应用 小试发酵确定的４株酵母用种曲机扩大培养制备成 酵母麸皮种后，按比例添加至酒曲中应用于中试车间进 行发酵，并以公司生产所用酒曲为对照。每天投粮量 １８０ ｋｇ，每株菌连续投料３批，发酵１６ ｄ，与当月酒曲产酒 进行色谱指标平均值及酒率（折５５％ｖｏ１）做比较，得出数 据见表３。 表３不同酵母应用于中试车间产酒主要风味物质 （ｇ／Ｌ） 从表３、图２可知，酒曲中添加产酯酵母Ｙ１０，出酒率 下降了１．９５％，而添加Ｙ２９和Ｙ４２，对出酒率无影响；添 加产酯酵母，产酒中乙酸乙酯含量均有不同程度的提高， 提高了９９．４％；添加Ｙ４２酒曲产酒中乙酸乙酯浓度为 １．５２３ ｇ／Ｌ，比对照组提高了５１．５％，而添加Ｙ１０的酒曲出 酒乙酸乙酯比对照组提高了２４＿３％。另外，添加产酯酵 母后正丙醇含量均比对照组减少，Ｙ１０、Ｙ２９和Ｙ４２分别 下降了５２．８％、４４．２％和４２．７％，这对降低原酒中缺陷性 成分——正丙醇有所贡献；添加产酯酵母后，杂醇油稍微 有所提高，其中添加Ｙ２９的高级醇含量提高了ｌ６．５％。 将原酒进行感官品评，添加产酯酵母的酒曲产出的原酒 清香纯正、入口醇甜、较干净，比对照曲酒体风味更优。 因此，在酒曲中添加产酯酵母，对于提高小曲白酒的乙酸 乙酯含量有一定的作用，在不影响出酒率情况下，进一步 提升了原酒质量。 ３结论 通过液态发酵初筛、小试固态发酵复筛从酒曲中获 得４株高产乙酸乙酯酵母菌株，并将其中３株应用于中试 车间，出酒后，乙酸乙酯含量均比不添加产酯酵母的酒曲 有所提升，其中编号Ｙ２９乙酸乙酯含量提高了９９．４％，且 添加产酯酵母后正丙醇含量均比对照组减少。出滔率方 面，除添加编号Ｙ１０酵母略有下降外，其余２株无影响。 后期可以调整产酯酵母的添加比例来消除对出酒率的影 响。感官品评，添加产酯酵母后，比对照组酒体风味更 优。因此，将产酯酵母制备麸皮种添加至酒曲中应用于 小曲白酒生产，可以有效地改善小曲白酒中酯含量低的 缺点，进一步提升了小曲白酒酒质。 参考文献： ［１］胡家俊．高产乙酸乙酯酵母的菌种选育［Ｊ］．食品与发酵科技， ２０１０（６）：８１—８３． ［２】严锦．小曲中产酯酵母的分离鉴定及其在酿酒生产中的应用 【Ｊ】．酿酒科技，２０１４（２）：４６—５２． ［３］董士伟．豉香型白酒中产酯酵母的筛选与应用［Ｊ］．中国酿造， ２０１２（２）：１２５—１２８． ［４】唐洁．舀良酒酵母和异常毕赤酵母混菌发酵对白酒液态发酵效 率和风味物质的影响［Ｊ］．微生物学通报，２０１２（７）：７９—８１．