组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA抑制结肠癌HT29细胞增殖作用的机制研究

叶消化肿瘤杂志渊电子版冤曳圆园员9年6月第11卷第2期允阅蚤早韵灶糟燥造渊耘造藻糟贼则燥灶蚤糟灾藻则泽蚤燥灶冤袁June圆园员9袁灾燥造11袁晕燥援2论著窑窑孟瑾1,2袁刘新利3袁车玲1袁陈明1袁吴漫1袁马晨珂1袁赵冠人1

1.总医院第八医学中心药剂科袁北京100091曰2.空军军医大学唐都医院肿瘤科袁陕西西安710038曰3.西北工业大学生命学院袁陕西西安710072

揖摘要铱制遥方法

目的

组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA抑制结肠癌HT29细胞增殖作用的机制研究探讨组蛋白去乙酰化酶抑制TSA对结肠癌HT29细胞增殖能力的影响及其作用机

以结肠癌HT29细胞为研究对象袁采用浓度梯度TSA处理并计算其对上述细胞的IC50

值袁并采用MTT法观察不同浓度TSA对结肠癌HT29细胞增殖能力的影响曰采用流式细胞术观察不同浓度TSA对结肠癌HT29细胞周期的影响曰Westernblot法观察不同浓度TSA对结肠癌HT29细胞中Ku70蛋白乙酰化水平以及对细胞周期蛋白CyclinB1尧CDC25C和周期抑制蛋白P21及其上游蛋白P53表达的影响遥结果MTT法和流式细胞术检测结果表明袁TSA可浓度依赖性抑制结肠癌HT29细胞的增殖并促进细胞发生G2/M期阻滞曰此外袁Westernblot检测结果表明TSA可明显上调结肠癌HT29细胞中Ku70蛋白的乙酰化水平袁同时上调周期抑制蛋白P21和P53的表达袁并抑制细胞周期相关蛋白CyclinB1和CDC25C的表达袁差异有统计学意义渊P<0.05冤遥结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂渊TSA冤可能通过促进结肠癌HT29细胞中Ku70蛋白乙酰化袁抑制其与DNA结合的亲和力而抑制DNA损伤修复袁进而促进结肠癌HT29细胞发生周期阻滞而发挥抗结肠癌细胞增殖并促进其周期阻止的作用袁为以细胞周期为靶点的肿瘤治疗策略提供理论依据和实验基础遥

揖关键词铱

结肠癌曰

TSA曰

Ku70乙酰化曰

周期阻止

EffectandmechanismofhistonedeacetylaseinhibitorTSAontheproliferationofcoloncancerHT29cells

MENGJin1,2,LiuXin-li3,CHELing1,CHENMing1,WUMan1,MaChen-ke1,ZHAOGuan-ren11.DepartmentofPharmacy,TheEighthMedicalCenterofPLA,Beijing100091,China

2.DepartmentofOncology,TangduHospital,AirForceMilitaryMedicalUniversity,Shaanxi,Xi'an710038,China3.Collegeoflife,NorthwesternPolytechnicalUniversity,Shaanxi,Xi'an710072,ChinatheproliferationofcoloncancerHT29cells.Methods

揖粤遭泽贼则葬糟贼铱

韵遭躁藻糟贼蚤增藻

ToinvestigatetheeffectandmechanismofhistonedeacetylaseinhibitorTSAon

TheIC50valuesofthecellswerecalculatedbyconcentrationgradientTSA,andtheeffectsofdifferentconcentrationsofTSAontheproliferationofcoloncancerHT29cellswereobservedbyMTTassay.TheeffectsofdifferentconcentrationsofTSAonthecellcycleofcoloncancerHT29wereobservedbyflowcytometry.andflowcytometryresultsshowedthatTSAcouldinhibittheproliferationofcoloncancerHT29cellsandThelevelsofKu70proteinacetylationandCyclinB1,CDC25CandcyclinP21incoloncancerHT29cellspromoteG2/Mphasearrestinaconcentration-dependentmanner.Inaddition,westernblotanalysisresultsshowedthatTSAcouldsignificantlyup-regulatetheacetylationlevelofKu70proteinincoloncancerHT29

ColoncancerHT29cellswereusedastheresearchobject.

wereobservedbyWesternblot.ItsupstreamregulationoftheexpressionofproteinP53.ResultsMTTassay

cells,andup-regulatetheexpressionofcyclicinhibitoryproteinsP21andP53,andinhibittheexpressionofConclusion

cellcycle-associatedproteinsCyclinB1andCDC25C.Thedifferencewasstatisticallysignificant渊P<0.05冤.

Histonedeacetylaseinhibitor渊TSA冤mayinhibittheDNAdamagebypromotingtheacetylation

基金项目院总医院第八医学中心课题基金项目渊2016MS-016冤曰陕西省自然科学基础研究计划项目作者简介院孟瑾袁主管药师袁E-mail院yzmengjin@163.com通讯作者院赵冠人袁副主任药师袁E-mail院yanliqun79@163.com渊2017JM8034冤

叶消化肿瘤杂志渊电子版冤曳圆园19年6月第11卷第2期允阅蚤早韵灶糟燥造渊耘造藻糟贼则燥灶蚤糟灾藻则泽蚤燥灶冤袁June圆园员9袁灾燥造11袁晕燥援2

ofKu70protein,inhibitingitsaffinityforDNAbinding,andthenpromotingcellcyclearrestofcoloncancerHT29cells.Furthermore,exertinganti-coloncancercellproliferationandpromotingitscyclearrest.Whichprovidesatheoreticalbasisandexperimentalbasisfortumortherapystrategiestargetingatcellcycleregulation.

揖运藻赠憎燥则凿泽铱

Coloncancer;

TSA;

Ku70acetylation;

Cyclearrest

结肠癌的发生发展是一个涉及多基因尧多因素尧多阶段致癌的复杂过程袁其中包括癌基因的激

活和抑癌基因的失活等咱1,2暂就诊时往往错过了最佳手术遥期临床袁导上致患多数癌者预症患后者较差袁而放化疗对患者副作用较大且疗效欠佳咱3,4暂因此袁阐明结肠癌的发病机制袁并针对其发病机制遥进行药物干预袁是临床上靶向结肠癌治疗取得根

本性突破需要迫切解决的难题遥Ku70蛋白是广泛存在于真核生物体内的一类核蛋白袁其功能和活性

受到翻译后修饰的咱5暂双链断裂修复尧DNA复制尧遥基因Ku70转蛋白通录过对以及DNA端粒

结构的维持等在多种细胞活动以及肿瘤发生发展进程中均扮演重要角色袁使其在肿瘤的预后尧发生

发展尧诊治中的作用成为近年来研究的热点咱6,7暂尽管Ku70蛋白在肿瘤中的生物学或许和作用日遥益突出袁但其对结肠癌发生发展的影响及作用机制目前尚未阐明咱8暂HDACs肿瘤作用抑制袁但其剂袁作有文遥Trichostatin用机献制报道有待其具有A渊TSA进一步较阐好冤属明的于咱9,10抗广暂恶谱性课题拟探讨组蛋白去乙酰化酶抑制HT29TSA对结肠遥癌本周期细胞为增靶殖点的肿瘤能力的影响治疗及其策作略用机提供制理袁论为以依据细胞遥1

材料与方法

1.1室馈赠材曰料TSA人结购自肠美癌国HT29Sigma细胞公司由曰德胎国合作实验牛血清尧胰蛋白酶消化液尧青链霉素混合液和高糖DMEM培养基均购自美国ThermoFisher公司曰BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司曰SDS-PAGE凝胶试剂盒尧MTT试剂尧细胞裂解液尧4%多聚甲醛溶液军购自西安碧云天科技生物有限公司曰DMSO购自上海生物化学试剂公司曰蛋白酶抑制剂购自瑞士Roche公司公司CyclinB1曰Ku70曰ECL和P53渊#2524渊#4138渊ab83501化学发光试剂盒购自美国Advansta冤冤尧一CDC25C冤尧抗分别渊acetylab226958-Ku70购自英国冤尧AbcamP21渊ab190626渊ab109199冤尧公司和冤美国CellSignalingTechnology公司曰兔/鼠二抗购自英国Abcam公司遥

1.2结肠癌MTTHT29筛选细胞并最佳给配置药成浓单度细胞取悬对液数袁生将上长期述人细胞以37益尧5%CO5伊104/2002培养滋箱L/中孔培养密度24接h种遥次于日96袁细胞孔板换中液于后

并分别给予0滋M渊等体积1培养滋M结和束5滋后M每的孔TSADNSO冤袁0.1滋M袁0.5滋M袁加入终浓20滋度L处的理并5mg/mL继续培养的MTT24h溶遥

液继续孵育4h袁弃上清每孔加入150滋L的DMSO充分振荡10min以促进结晶物溶解袁酶联免疫检测仪IC50570nm处检测吸光值渊OD冤并计算TSA的

1.3值并集对数Western选取生长期blot本研究中结肠检测癌HT29Ku70TSA细胞后蛋白的最乙佳提酰处取化理总水浓蛋白平度遥遥收采

用BCA蛋白采用SDS-PAGE备蛋白定量试样蛋白品剂并盒凝计检测胶算蛋白浓度袁沸水浴10min制试剂30盒滋g进蛋白行凝上胶样电体泳积并遥

转膜曰转膜完成将NC膜采用5%丽春红染液染色并裁剪目的条带曰随后又将目的蛋白条带与5%脱脂牛奶室温封闭1h曰将目的蛋白条带与相应的一抗稀释液P21用PBST和P53清蛋白Ku70尧acetyl-Ku70尧CyclinB1尧CDC25C尧

洗目的一抗条稀带释后液与41益颐5000过夜孵稀释育山遥次羊日抗袁兔采/鼠二抗室温孵育1.4癌HT29MTT细胞并细胞增1制殖h遥备实验ECL显单细胞悬收色液集后袁对观察调数蛋白表达遥整生细胞密长期结度肠为

3CO伊1042培养/200箱滋L/中孔培养接种遥次于日96袁待孔细胞培养铺满孔板于37底益袁分尧5%别给予0.1滋M尧0.5滋M和1滋M终浓度TSA处理袁每组浓度设置3-5个复孔袁继续培养24h-96h袁倒置显微镜下观察不同浓度TSA对结肠癌HT29细胞增殖能力的影响遥每孔加入5mg/mL的MTT溶液DMSO20滋L用酶联免疫充继分续振培养检测荡仪104570minh后nm以弃促上处进清检测结袁晶加吸全入光度部150溶解滋L的

袁采1.5生长期流结式肠细胞遥

癌HT29术检测细胞并周期制细胞分备单细胞布悬收液集袁对调数整

细胞密度为37益尧5%CO3伊1052培养箱/200内滋培养L/孔接24种h于使细胞6孔培养贴壁板遥于设

90

叶消化肿瘤杂志渊电子版冤曳圆园员9年6月第11卷第2期允阅蚤早韵灶糟燥造渊耘造藻糟贼则燥灶蚤糟灾藻则泽蚤燥灶冤袁June圆园员9袁灾燥造11袁晕燥援2置空白对照孔渊含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液冤和0.1滋M尧0.5滋M尧1滋M不同浓度TSA24h处理组遥收集并重悬细胞袁调整细胞密度为103-6伊6个/1mL曰采用微量移液器吸取500滋L细胞悬

液至10mL离心管内袁边振荡边加入5mL的70%冰乙醇中4益过夜固定曰次日袁采用PBS洗涤细胞两次渊仪PI检测冤染袁300液细周4g离心益期中孵育5G13min后加入尧hS曰尧400和目G2/M筛网500期过滋各滤L碘化丙啶时相细胞曰流式细胞

的分布情况1.6遥

对数Western生长期结blot肠检测癌HT29周期相关细胞蛋白的空表达白对照收集组TSA渊DMSO处理冤和0.1滋M尧0.5滋M尧1滋M不同浓度

剂盒24检测h处蛋白理组细胞并浓度并制提备取蛋白总蛋白样品遥袁计采算用30BCA滋g试蛋白上样体积遥采用SDS-PAGE凝胶试剂盒进行蛋白电泳并转膜袁转膜结束后将NC膜浸入5%丽春红染液中染色袁随后根据目的蛋白分子量大小裁

剪目的蛋白条带袁去离子水清洗NC膜至无色袁5%脱脂奶粉室温封闭1h曰将目的蛋白条带与适当浓度稀释的CyclinB1尧CDC25C尧P21和P53抗体4益孵育过夜曰次日袁室温清洗NC膜3次曰将目的条带与二抗渊羊抗兔/鼠1颐5000冤室温孵育1h后清洗遥ECL显色并检测软件进行计学数据方分析法袁所目的蛋白的多组有数间据采计量用表达1.7统资SPSS20.0遥

料采用方差统计分析袁方差齐后进一步采用student-t检验袁以均渊曾依泽冤表示曰计数资料采用字2检验袁以百分比渊%冤表示曰所有统计检验均为双侧检验袁P<0.05表明差异有统计学意义遥2

结果

2.1定采TSA用对IC50值结果MTT结肠见图法癌检测HT29TSA细胞对结的肠最癌佳HT29给药浓细胞度确的

抑制结肠癌渊HT291细胞遥结的生果表明长袁袁差异TSA可有浓统度计学依赖意性义

*P<0.05冤袁并经计算其IC50=1.005滋M遥因此袁为进一步明确TSA对上述结肠癌细胞的抑制作用同时不影响实验结果准确性的前提下4袁本研究中选取

12.2滋个M不冤袁观察同终其对浓度结的肠TSA癌细胞渊0增滋M殖尧0.1及周滋M期的尧0.5滋M和的乙酰TSA化可Western促进结肠影响遥blot癌检测HT29TSA细胞对中结Ku70肠癌HT29

蛋白图1MTT检测结果表明TSA可浓度依赖性抑制抑制结

肠癌HT29细胞生长

细胞中Ku70蛋白乙酰化水平的影响见图2遥结果表明袁白表达细胞与DMSO无明显中组相比袁TSA可显著上调结肠癌HT29Ku70影响的袁差异乙酰有化统水计学平袁而意对义Ku70渊*P<0.05总蛋袁

**

P<0.01冤遥

图2

TSA可显著上调结肠癌HT29细胞中Ku70蛋白的

乙酰化水平

2.3能力检测MTT结法果细胞见图增殖TSA可显著抑制3遥能力结果检测结肠癌表明与MTT对照细胞组相增比殖HT29细胞增殖袁且其抑制

袁

叶消化肿瘤杂志渊电子版冤曳圆园19年6月第11卷第2期允阅蚤早韵灶糟燥造渊耘造藻糟贼则燥灶蚤糟灾藻则泽蚤燥灶冤袁June圆园员9袁灾燥造11袁晕燥援291

作用呈浓度依赖性袁差异有统计学意义渊*P<0.05袁

**

P<0.01袁***P<0.001冤遥

图3MTT法检测TSA对结肠癌HT129细胞增殖能力影响

2.4周期分流布式细胞细胞仪流检测式检测TSA结处果理后见图结4遥肠结癌细胞的G2/M可2.5

期浓阻滞度依袁blot差异赖性检测有地统诱蛋白计学导结表达

意肠义癌果表明TSA渊*HT29细胞发生袁WesternPWestern<0.05冤遥

blot检

图4流式细胞仪观察TSA对结肠癌HT29细胞周期中G1尧

S和G2/M期各时相细胞分布的影响

测结果见图5遥结果表明袁不同浓度TSA处理能够显著抑制G2/M期蛋白CyclinB1的表达袁同时增强G2/M期抑制蛋白P21的表达袁差异有统计学意义渊*P<0.05冤遥

图5Westernblot检测不同浓度TSA对结肠癌HT29细胞

周期蛋白表达的影响

3讨论

近年来袁结/直肠癌在西方国家的发病率与死

亡率位居恶性肿瘤的前3位咱11暂亡率已位于恶性肿瘤死亡率排遥名我第国四结位肠袁癌仅的次于

死

胃癌尧肺癌和食道癌袁严重危害人类健康咱12暂资料表明袁我国结/直肠癌发病率与死亡率将遥相关

在今后很长一段时间内呈快速上升趋势袁将成为常见而高发的恶性肿瘤咱13暂典型症状和体征袁容易遥被临床患者上忽由于视袁患也容者早易期漏缺诊乏袁

92

叶消化肿瘤杂志渊电子版冤曳圆园员9年6月第11卷第2期允阅蚤早韵灶糟燥造渊耘造藻糟贼则燥灶蚤糟灾藻则泽蚤燥灶冤袁June圆园员9袁灾燥造11袁晕燥援2大部分患者已经属于中尧晚期袁往往错过了最佳手术时机袁患者预后较差遥因此袁阐明结肠癌的发病机制袁并针对发病机制进行药物干预袁是结肠癌治疗取得根本性突破需要迫切解决的课题遥

失控性生长是肿瘤细胞的共同生物学特性袁主要分子机制为细胞周期紊乱导致细胞凋亡减少

和增殖增加咱14暂瘤发生的重要机遥制研究咱15暂表明细胞周期异常是肿核生物体内的核蛋白遥袁Ku70研究发是一种现Ku70广泛在存DNA在于真双链断裂修复尧DNA复制尧基因转录和维持端粒结构等多种细胞进程中均扮演重要角色咱16暂通过参与Rad3/Rad26渊细胞周期检查点相关遥蛋白Ku70冤途径袁发挥维持端粒稳定性尧防止染色体环状化作用进而维持细胞周期的正常进行咱17暂现Ku70蛋白活性和功能受翻译后修遥此外饰袁研究袁其发乙酰化和去乙酰化状态在肿瘤细胞凋亡和修挥重要的作用咱18暂依赖于细胞周期蛋白遥真核渊cyclins生物细胞冤尧周细胞期的周正常复中期蛋白进行发

依赖性激酶渊渊CDKs冤尧细胞周期依赖性激酶抑制因子

白CKIs袁在冤G1之间检查的正点作负调用节咱19暂于CDK/cyclin遥CKIs是一复合类小物分袁子蛋阻止细胞周期运行和细胞增殖分化袁抑制细胞向恶性转化遥p21作为抑癌基因是细胞周期重要因子袁是依赖周期素的蛋白激酶抑制因子渊CKIs冤中的一员咱20暂制细胞增殖遥的作p21的用表达减弱减袁弱或或使消细胞失可正常能会增造生成转抑变为增生分化不良袁导致肿瘤发生的可能遥细胞周期紊乱是导致基因组不稳定的重要环节袁增加不稳

定细胞的癌变几率从而参与肿瘤的发生发展咱21暂因此袁细胞周期在细胞增殖和凋亡中的对于遥

维护基因组的稳定性具有十分重要的意义遥

组蛋白乙酰化和去乙酰化影响染色质重塑袁在基因表达的表观遗传中扮演着十分重要的角色遥研究报道组蛋白乙酰化和去乙酰化主要就

是通过HDACsHATs和HDACs来实现的咱22暂遥目前有报道些18酶种归袁根据包含为4其多种型与袁酵母类型袁其中HDACs其中人体I型包括的同已源经性知袁可道的以就有将这

白HDAC3和某些和非HDAC8HDAC1尧HDAC2尧咱23暂组蛋白异常遥近去年乙来酰大化与量研究结表明/直肠袁癌组的蛋

发生发展基因敲除过表达可有着十I型HDACs促分密切进结的关系袁研究证实I型HDACs中的/直肠1/2/3癌细胞得能明显有生长效袁采抑制

用结肠癌HCT116种强效尧特异而抑细胞可菌素尧HT29细胞和A渊TrichostatinSW480细胞的生长咱24-26暂遥曲古A,TSA冤是一然产物咱27暂遥研究证实逆的第一个能抑制天细胞均表现出具有抗癌TSA活性对多种组织咱28,29暂来源HDAC的肿瘤

的性结合HDAC上的催化位点而发挥袁通作过与用底袁物其有竞争

效抑制剂量可达纳摩尔级浓度袁具有很强的抑制组蛋白去乙酰化酶活性遥近年来TSA因具有高特异性尧高效性尧稳定性尧低毒性等优点而备受关注遥尽管国内外对TSA的抗肿瘤作用已经进行了一系列相关研究袁但其具体抗癌作用机制仍有待进一步阐明遥

本课题通过观察采用不同浓度HT29TSA对结肠癌

制袁采细胞用MTT增殖细胞能力增周殖期进实验程和的流影响式细胞及其术作观察用机不同浓度TSA对结肠癌HT29细胞增殖能力和周期中TSAG1尧S尧和且流可式浓细胞度依G2/M实验赖性期结抑制各时相细胞果表明结肠随着癌的分布HT29TSA给细胞袁结果表明

药浓的度增的殖升袁高袁处于G2/M期的细胞比例逐渐增加袁表明TSA可浓度依赖性诱导细胞发生G2/M期阻滞遥为进一步探究TSA对结肠癌HT29细胞增殖抑制的作用机制袁采用esternblot检测TSA对结肠啊HT29细胞中Ku70乙酰化水平的影响袁结果表明TSA可浓度依赖性显著上调acytel-Ku70蛋白水平遥此外袁在细胞周期进程中袁P21和P53作为周期依赖性蛋白激酶抑制剂是重要细胞周期分子Western结肠癌HT29blot结细胞果显示中P21袁TSA和可P53浓的蛋白度依赖遥

表达性地水上平调袁同时下调G2/M期蛋白CyclinB1和CDC25C的表达袁提示TSA介导的细胞周期阻滞是其抗结肠癌的重要机制渊遥综上所述袁组蛋白去乙酰化酶抑制剂

白TSA乙酰冤可化能DNA袁通抑制过促其进与结DNA肠癌结HT29合的细胞亲和中力Ku70而抑制

蛋周期阻滞损伤而修发挥复袁抗进结而促肠癌细胞进结肠增癌殖并HT29促细胞发进其周生期阻止的作用袁为以细胞周期为靶点的肿瘤治疗策略提供理论依据和实验基础遥

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