・２２０４・ 广东医学２０１３年７月第３４卷第１４期 ＧｕａｎｇｄｏｎｇＭｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｊｕ１．２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．１４ ［７］ＣＡＳＥＹ Ｐ Ｂ，ＰＥＸＥＲ Ｅ Ｍ，ＭＩＣＨＥＬＬ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＰＣＳ／ＥＣ／ＥＡＰＣＣＴ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｉｎ ｃａｓｅｓ ｏｆ 供参考，从而提高医疗水平，减少医患矛盾。 参考文献 ［１］ＰＥＲＳＳＯＮ Ｈ Ｅ，ＳＪＯＢＥＲＧ Ｇ Ｋ，ＨＡＩＮＥＳ Ｊ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ．Ｇｒａｄｉｎｇ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｔｏｘｉ— ｃｏｌ，１９９８，３６（３）：２０５—２１３． ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｔｏｘｉｅｏｌ Ｃｌｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌ，１９９８，３６（３）：２１５—２１７． ［８］ ＳＡＭ Ｋ Ｇ，ＫＯＮＤＡＢＯＬＵ Ｋ，ＰＡ耵Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ．ＡＰＡＣＨＥⅡａｎｄ ＧＣＳ：ｅｆｅｃｔｉｖｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｄｉｃｅｓ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ ｅａｒｂａ— ［２］ 尚继越．急悱一氧化碳中毒的治疗进展［Ｊ］．人民军医，２００３， ９（１）：１０２３—１０２４． ｍａｔｅ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｊ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｋｇ Ｍｅｄ，２００９，１６（５）：２３９—２４７ 『９］ ＣＥＶＩＫ Ａ Ａ，ＵＮＬＵＯＧＬＵ Ｌ，ＹＡＮＴＵＲＡＬＩ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ，ｃａｒｂｏｘｙｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ［３］ 张福苓．一氧化碳中毒迟发性脑病的预见及护理进展［Ｊ］．内 蒙 中医药，２０１ｌ，３０（１）：１５６—１５７． ［４］ 秦慧，岑志远．院前急救对中重度急性有机磷农药中毒患者 预后的研究［Ｊ］．广西中医学院学报，２０１２，１５（２）：３３—３５． ａｎｄ ｉｎ—ｈｏｓｐｉｔａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｏ１ ｃａｒｂｏｎ ｍｏｎｏｘｉｄｅ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ，２００６，６０（１２）：１５５８—１５６４． ［１Ｏ］胡莹莹，邓跃林，张国秀，等．中毒严重度评分在急件自‘机磷 中毒救治中的应用研究［Ｊ］．巾国急救医学，２００９，２９（３）： ２００—２０２． ［５］ 邱俏檬，洪厂亮，刘刚，等．温州地区急性农药中毒特点及预 后影响因素研究［Ｊ］．浙江预防医学，２００７，１９（６）：１—３． ［６］ 刘毅，陈兵，杨丽敏，等中毒严重度评分在急性中毒患者中 的应用［Ｊ］．中国急救医学，２００９，２９（９）：８３６—８３８． （收稿日期：２０１２—１２一ｌ２编辑：陈嘉伟） ｍｉＲ一２５在胃癌组织中的表达 邓银芝 湖北省恩施自治州中心医院消化内科（４４５０００） 【摘要】 目的分析胃癌组织中ｍｉＲ一２５的表达及其靶基因预测。方法选取胃癌及配对癌旁正常组织标 本３０例，应用荧光定量ＰＣＲ检测ｍｉＲ一２５的表达水平，利用生物信息学软件、荧光素酶实验和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ预测 和验证ｍｉＲ一２５的靶基因。结果中表达显著下降（Ｐ＜０．０５）。结论ｍｉＲ一２５在胃癌组织中的表达显著高于配对的癌旁正常组织（Ｐ＜０．０５）。荧 ｍｉＲ一２５在胃癌组织中高表达，可能在胃癌的发病中发挥重要作用。 光素酶实验和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验表明Ｆ框／ｗＤ一４０域蛋白７（ＦＢＸＷ７）是ｍｉＲ一２５的靶基因。ＦＢＸＷ７在胃癌组织 【关键词】 胃癌；ｍｉＲ一２５；Ｆ框／ＷＤ一４０域蛋白７ 胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，胃癌发病率在各 种肿瘤中排第４位，其致死率排第２位，但其发病机制 尚未清楚。近年研究表明，微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲ） 在肿瘤的发病中发挥重要的调节作用。以往基因芯片 １．２．２ ｍｉＲ一２５表达的检测 ｍｉＲ的检测按照天根 公司ｍｉＲｃｕｔｅ荧光定量检测试剂盒进行操作。ｍｉＲ一 ２５和内参ｕ６的检测引物购买自广州复能公司。采用 ２一…法计算ｍｉＲ一２５的表达量，并以ｕ６进行标化。 １．２．３ 靶基因预测 应用ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ和Ｍｉ— 报道ｍｉＲ一２５在胃癌中呈异常表达，但其与胃癌临床 病理的关系尚不明确…。本研究应用荧光定量ＰＣＲ 技术对ｍｉＲ一２５在胃癌及配对癌旁正常组织中的表达 Ｒａｎｄａ对ｍｉＲ一２５进行靶基因预测，选取３个软件均 能预测到的基因作为靶基因。 １．２．４荧光素酶分析将包含ｍｉＲ一２５预测结合位 点的Ｆ框／ＷＤ一４０域蛋白７（ＦＢＸＷ７）序列（ＦＢＸＷ７ ３ 非编码区域１５９６～１６０３位置）克隆到ｐｓｉＣＨＥＣＫ一２载 水平进行检测，并利用生物信息学软件进行靶基因预 测，初步探讨ｍｉＲ一２５在胃癌发病中的作用，为进一步 的研究提供依据。 １资料与方法 １．１一般资料选取２０１１年６月至２０１２年６月在我 体中，同时以共转染对照载体作为对照，ｍｉＲ一２５预测 位点突变体质粒构建按照武汉摩尔生物的定点突变试 剂盒进行操作。为进一步验证ＦＢＸＷ７是否为ｍｉＲ一 ２５靶基因，在ＨＥＫ２９３细胞中分别转染ｍｉＲ一２５过表 达质粒（ｍｉＲ一２５组，ｍｉＲ一２５过表达质粒购买自广州 复能）及其对照载体质粒（对照组），再通过Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ来检测ＦＢＸＷ７的蛋白水平。在ＨＥＫ２９３细胞中 院行外科切除术的胃癌患者３０例，其中男１８例，女１２ 例；年龄４０～７５岁，平均（５７±１０．２）岁。所有癌症患 者均没有进行术前的化疗及放疗。切取胃癌及癌旁７ ｃｍ以上的正常组织标本。所有标本均通过术后病理 检查证实。 １．２ 方法 １．２．１样品处理及ｍｉＲ提取样品保存在一８０℃冰 进行的荧光素酶实验操作按照Ｐｒｏｇｅｍａ公司的双萤光 素酶检测试剂盒进行。 １．２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ用碧云天的组织或者细胞裂解 箱中。ｍｉＲ的提取按照天根公司的ｍｉＲｃｕｔｅ ｍｉＲＮＡ提 取试剂盒进行操作。并采用加Ｐｏｌｙ（Ａ）尾法进行逆转 录，得到ｃＤＮＡ。 液裂解样品，提取蛋白后，经沸水煮１０ ｒａｉｎ，ＢＣＡ法测 蛋白浓度。蛋白样品中加溴酚蓝至０．０５％，Ｂ一巯基 广东医学２０１３年７月第３４卷第】４期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｊｕ１．２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．１４ ・２２０５・ 乙醇至终浓度１０％。蛋白样品在１０％的ＳＤＳ胶中进 行凝胶电泳，凝胶电泳结束后转到ＮＣ膜上，用３％ ＢＳＡ封闭４０ ａｒｉｎ后，４℃孵育一抗过夜。对应的二抗使 用Ｌｉｃｏｒ公司的荧光二抗。用Ｌｉｃｏｒ公司Ｏｄｙｓｓｅｙ软件 分析灰度值。 １．３ 统计学方法 采用ＳＰＳＳ １６．０统计软件，采用 Ｓｔｕｄｅｎｔ Ｓ ｔ检验。 ２ 结果 ３讨论 ｍｉＲ是内源性保守的非编码短链ＲＮＡ，成熟的 ｍｉＲ一般长度为２２～２５个核苷酸，ｍｉＲ通过与靶基因 ２．１ ｍｉＲ一２５表达水平 ｍｉＲ一２５在胃癌组织中的 相对表达量为１．５２±０．２４，在癌旁正常组织中的相对 ｍＲＮＡ的３ 非编码区域以碱基配对方式结合，从而抑 制翻译过程或者导致ｍＲＮＡ降解 。许多研究表明在 各种肿瘤组织中都有大量的ｍｉＲ表达异常，并证实 ｍｉＲ参与了肿瘤的发生发展 。ｍｉＲ一２５属于ｍｉＲ一 １０６ｂ一２５基因簇，由ｍｉＲ一２５、ｍｉＲ一９３和ｍｉＲ一１０６ｂ 组成，与ｍｉＲ一１７—９２原癌基因簇有着高度的同源 性 。ｍｉＲ一２５在胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌等多种 表达量为１．００±０．１８，ｍｉＲ一２５在胃癌组织中表达显 著升高（Ｐ＜０．０５）。 ２．２ ｍｉＲ一２５靶基因预测通过生物信息学软件预 测后，我们挑选了ＦＢＸＷ７这个基因。荧光素酶实验发 现，野生型ＦＢＸＷ７ ３ 非编码区和对照载体共转染组相 对荧光酶活性为１．００±０．２５，野生型ＦＢＸＷ７ ３ 非编码 区和ｍｉＲ一２５共转染组相对荧光酶活性为０．４６± ０．１１，ｍｉＲ一２５能够显著抑制包含野生型ＦＢＸＷ７非编 码区序列质粒的荧光素酶活性（Ｐ＜０．０５）；突变型 ＦＢＸＷ７ ３ 非编码区和对照载体共转染组相对荧光酶活 性为１．００＿４－０．１４，突变型ＦＢＸＷ７ ３ 非编码区和ｍｉＲ一２５ 共转染组相对荧光酶活性为０．９７±０．２１，ｍｉＲ一２５对包 含突变体的ＦＢＸＷ７非编码区序列质粒的荧光素酶活 性没有影响（Ｐ＞０．０５）。 ２．３ ｍｉＲ一２５对ＦＢＸＷ７表达的影响 对照组 ＦＢＸＷ７相对灰度值为１．００±０．２１，ｍｉＲ一２５组 ＦＢＸＷ７的相对灰度值为０．５２±０．１３，ｍｉＲ一２５过表达 可以显著抑制ＦＢＸＷ７的蛋白水平（Ｐ＜０．０５），见图１。 ｐ－ａｃｔｉｎ 对照组 图Ｉ ｍｉＲ一２５对ＦＢＸＷ７蛋自录达的影响 ２．４ ＦＢＸＷ７在胃癌及癌旁组织中的表达 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测显示，胃癌组织中ＦＢＸＷ７的相对灰度值为 ０．５６±０．２７，癌旁正常组织中ＦＢＸＷ７相对灰度值为 １．００±０．２４，胃癌组织中ＦＢＸＷ７的蛋白含量显著低于 配对癌旁正常组织（Ｐ＜０．０５），见图２。 ６８ ｋＤ Ｂ—ａｃｔｉｎ ４７ｋＤ 癌旁 胃癌 图２ ＦＢＸＷ７在胄癌及癌旁组织中的表达 肿瘤组织中高表达 。ｍｉＲ一２５可以直接调控ｐ５３的 表达和活性参与ｐ５３信号通路的调节，ｍｉＲ一２５被认 为是一种诱癌基因 。本研究证实ｍｉＲ一２５在胃癌组 织中表达显著升高，与之前ＬＩ等…通过基因芯片筛选 的结果一致。 ＦＢＸＷ７作为一种广泛的抑癌分子，在泛素蛋白酶 体介导的降解通路中发挥重要作用。它由Ｆ—ｂｏｘ、 ＷＤ４０重复序列以及Ｄ结构域３个保守结构域组成。 ＦＢＸＷ７缺失会诱导Ｃｙｅｌｉｎ Ｅ、Ｍｙｃ等蛋白的大量聚集， 进而加速癌细胞增殖 ７１。ＦＢＸＷ７在多种肿瘤组织中表 现出低表达。国外报道ＦＢＸＷ７的低表达与胃癌细胞的 分化程度、淋巴转移和ＴＮＭ分期密切相关，表明ＦＢＸＷ７ 与胃癌的发生、发展有关 。ＦＢＸＷ７介导Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ的降 解，ＦＢＸＷ７表达异常会导致Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ降解障碍，进而引 发细胞增殖失控 。本研究进一步证实ｍｉＲ一２５能够 负向调节ＦＢＸＷ７的表达。 本研究对ｍｉＲ一２５在胃癌组织中的表达水平进行 了验证，并证实ＦＢＸＷ７是ｍｉＲ一２５的靶基因，为后续研 究ｍｉＲ一２５在胃癌发病过程中的作用提供了重要依据。 参考文献 ［１］ １．１ Ｘ，ＺＨＡＮＧ Ｙ，ＺＨＡＮＧ Ｈ，ｅｔ ａ１．ｍｉＲＮＡ一２２３ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇａｓ— ｔｒｌｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＥＰＢ４１Ｌ３［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１，９（７）：８２４—８３３． ［２］ ＯＳＭＡＮ Ａ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ一一ｂａｓｉｃ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｉａｂ，２０１２，５８（５／６）：３９３—４０２． ３ ｌ ＫＯＮＧ Ｙ Ｗ，ＦＥＲＩ ＡＮＤ ＭＣＣＯＬＬＯＵＧＨ Ｄ，ＪＡＣＫＳＯＮ Ｔ Ｊ，ｅｔ ａ１．ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ，２０１ ２， １３（６）：ｅ２４９一ｅ２５８． ［４］ 张安玲，浦佩玉．微ＲＮＡ一１０６ｂ一２５基因簇在肿瘤中的研究 进展［Ｊ］．国际肿瘤学杂志，２０１１，３８（３）：１６３—１６６． ［５］熊青，徐龙．血清ｎｉｉｃｒｏＲＮＡｓ在胃肠道疾病中的意义［Ｊ］．世 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