(12)发明专利申请
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104101706 A(43)申请公布日 2014.10.15
(21)申请号 201410363297.8(22)申请日 2014.07.28
(71)申请人国家纳米科学中心
地址100190 北京市海淀区中关村北一条
11号(72)发明人蒋兴宇 曹丰晶 张伟 陈翊平
陈雯雯 赵大龙(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司
11332
代理人巩克栋 侯桂丽(51)Int.Cl.
G01N 33/569(2006.01)
权利要求书2页 说明书6页 附图6页权利要求书2页 说明书6页 附图6页
(54)发明名称
一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法(57)摘要
本发明涉及一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法，所述试纸条包括底板和顺次搭接粘贴在所述底板上的样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中结合物垫为金标-生物素结合物垫和链霉亲和素-金-抗体结合物垫的组合；所述检测甲流抗原的方法中，将待检样品滴加在所述的试纸条上，若在检测线(1)处显示红色条带，则说明所述待检样品中含有甲流抗原。本发明的试纸条具有价格便宜、快速和简便的优点，非常适合现场检测，并能够满足较高检测灵敏度的需求，具有重要的临床诊断意义。CN 104101706 A CN 104101706 A
权 利 要 求 书
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1.一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条，包括底板、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于，
所述结合物垫包括：1)金标-生物素结合物垫；和2)链霉亲和素-金-抗体结合物垫；
所述硝酸纤维素膜上包被检测线(1)和质控线(2)，所述检测线(1)处的抗体为甲流的包被抗体；所述质控线(2)处的抗体为羊抗鼠IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述金标-生物素结合物垫为涂覆有生物素标记的胶体金；优选地，所述链霉亲和素-金-抗体结合物垫为涂覆有链霉亲和素和甲流抗体标记的胶体金；
优选地，所述链霉亲和素和甲流抗体的比例为1：(1-10)，优选为1:5。3.根据权利要求1或2所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维膜和吸水纸依次相互搭接地贴在底板上。4.根据权利要求1-3任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述底板为聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)或玻璃片中的任意一种，优选为聚氯乙烯；优选地，所述样品垫为玻璃纤维膜；优选地，所述结合物垫为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜或人造纤维中的任意一种，优选为玻璃纤维膜。
5.根据权利要求1-4任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，还包括卡壳盖和卡壳底，所述卡壳盖和卡壳底形成容纳空间，用于容纳所述胶体金免疫层析试纸条；
优选地，所述卡壳上开有加样区(3)和显色区(4)。
6.一种权利要求1-5任一项所述的胶体金免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)链霉亲和素-金-抗体结合物垫的制备调节胶体金溶液的pH值，然后加入甲流标记抗体和链霉亲和素，在室温下振荡反应，然后分两次加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
2)金标-生物素结合物垫的制备调节胶体金溶液的pH值，然后加入生物素，在室温下振荡反应，然后分两次加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
3)胶体金免疫层析试纸条的组装将羊抗鼠IgG和甲流的包被抗体，分别作为质控线(2)和检测线(1)包被在硝酸纤维素膜上，然后将样品垫、金标-生物素结合物垫，链霉亲和素-金-抗体结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在底板上，并进行组装即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述胶体金溶液的pH值调整为7.0-9.0，优选为7.1-8.5；更优选为8.5；
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权 利 要 求 书
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优选地，分两次加入的BSA溶液的浓度分别为10％和1％；
优选地，所述室温下振荡反应时间为30min；加入BSA溶液封闭位点后的反应时间为0.5-1小时；所述离心时间为30分钟；所述离心转速为10000-12000r/min。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述恢复液包括50mM的NaCl，1％的BSA，0.5％的蔗糖和0.5％的酪蛋白钠。
9.一种检测甲流抗原的方法，其特征在于，采用权利要求1-5任一项所述的胶体金免疫层析试纸条，包括如下步骤：
1)将待测样品加到所述试纸条上，免疫层析反应5-10min；
2)肉眼观察所述试纸条上检测线(1)和质控线(2)上胶体金的颜色，得到所述试纸条检测甲流抗原的结果。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，当检测线(1)和质控线(2)均显示红色条带时，则说明所述待测样品中含有甲流抗原。
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一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗
原的方法
技术领域
本发明属于免疫检测分析技术领域。具体涉及一种胶体金免疫层析试纸条及检测
甲流抗原的方法，尤其涉及一种基于信号增强的胶体金免疫层析试纸条及使用该试纸条检测甲流抗原的方法。
[0001]
背景技术
流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、
传播速度快的疾病。其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。[0003] 流感是由流感病毒引起的流行性感冒，病毒属正粘病毒科，直径80～120nm，球形或丝状。流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，传播迅速，极易发生大范围流行。
[0004] 甲型H1N1是甲型流感病毒的一种，本病具有自限性，但对于婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者而言，容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。因而正确诊断此病原体对迅速治愈具有十分重要的意义。[0005] 目前，对于流感病毒的检测已有诸多相关专利申请公开，例如，CN1869703A公开了禽流感病毒(H5N1亚型)血清抗体的aGST-ELISA检测方法，该发明所采用的技术手段是使所述高纯融合蛋白GST-HA1在酶联板上用抗GST单抗捕获融合蛋白GST-HA1而制成；CN101899529A公开了一种基于颜色的环介导逆转录等温扩增技术检测人甲型H1N1流感病毒基因，其具体是应用基因颜色的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，通过计算机软件分析人甲型H1N1流感病毒HA基因的保守序列，设计出六条引物完全与识别的HA靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，最后用肉眼观察颜色变化和管底的白色沉淀判定检测结果；CN102086476A公开的是一种利用多重荧光定量RT-PCR同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒，用于对发热病人咽拭子等标本的人新甲型H1N1流感病毒及人季节性H1N1和H3N2流感病毒HA基因的同时检测和监测。
[0006] 对于甲型流感病毒的检测，目前公开的相关专利申请主要有：CN1591014A，其公开了一种甲型流感病毒胶体金快速检测试纸，其涉及保藏号CGMCC0987的杂交瘤细胞株产生的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，及含有该单克隆抗体的甲型流感病毒胶体金快速检测试纸；CN102286639A公开了甲型H1N1/甲型流感病毒核酸双重荧光PCR检测试剂盒，其包括RNA酶抑制剂、RT-PCR反应液、酶混合液、甲型H1N1/甲型流感病毒双重反应液、阳性
还提供了含对照和阴性对照；CN102952896A提供了用于检测甲型流感病毒的引物和探针，
有用于检测甲型流感病毒的这类引物和探针的制品。
[0007] Suwussa Bamrungsap等人应用荧光掺杂的硅纳米颗粒作为示踪物，并借助于一
[0002]
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个信号读出仪器进行流感病毒抗原的检测(参考文献：“Rapid and sensitive lateral flow immunoassay for influenza antigen using fluorescently-doped silica nanoparticles”，Suwussa Bamrungsap，Chayachon Apiwat，Warangkana Chantima，Tararaj Dharakul，Natpapas Wiriyachaiporn.MICROCHIMICA ACTA2014，181：223-230.)；Sun,Jianbin等人主要研究了基于超顺磁性的磁珠的免疫层析试纸条，通过免疫夹心法进行检测H1N1病毒抗原，灵敏度能够达到100pg/mL，该方法只能进行抗原的检测(参考文献：“Development and Evaluation of a Paramagnetic Nanoparticle Based Immuno chromatographic Strip for Specific Detection of 2009 H1N1 Influenza Virus”，Lei Xiaoying；Wang Weihua；Liu Yonglan；Liang Ping；Bao Han；Wang Qin；Guo，Yanhai；Yang，Jinghua；Yan Zhen.JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY.2013，13，1684-1690.)。
[0008] 上述涉及流感抗原检测的相关文献，普遍存在操作复杂，灵敏度差，读取结果不容易获得等缺陷，因而寻找一种灵敏度高、读取结果快捷而直观等特点的检测方法具有重要的临床诊断意义。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法，特别是一种基于信号增强的胶体金免疫层析试纸条及使用该试纸条高灵敏检测甲流抗原的方法。
[0010] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：[0011] 在第一方面，本发明提供了一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条，包括底板、样品垫、结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合物垫包括：1)金标-生物素结合物垫；和2)链霉亲和素-金-抗体结合物垫；所述硝酸纤维素膜上包被检测线1和质控线2，所述检测线1处的抗体为甲流的包被抗体；所述质控线2处的抗体为羊抗鼠IgG抗体。[0012] 本发明中，所述金标-生物素结合物垫为涂覆有生物素标记的胶体金；所述链霉亲和素-金-抗体结合物垫为涂覆有链霉亲和素和甲流抗体标记的胶体金。
[0013] 本发明通过采用生物素标记的金纳米颗粒以及链霉亲和素和甲流抗体标记的金纳米颗粒作为增强探针，进行信号放大，提高了检测甲流抗原的灵敏度，可以使灵敏度提高到6ppb-12.5ppb。
[0014] 作为优选技术方案，所述链霉亲和素和抗体的比例为1：(1-10)，例如可以是0.5:5、1:5、2:5、3:5、4:5、5:5，优选为1:5。
[0015] 链霉亲和素和抗体的比例达到1:5时，可以使检测灵敏度达到6ppb。[0016] 作为优选技术方案，所述样品垫、结合物垫、硝酸纤维膜和吸水纸依次相互搭接地贴在底板上。
[0017] 本发明中，所述底板的作用在于支持所述吸水纸和硝酸纤维素膜等，其材料不作限定，可以是聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯(PE)和玻璃片等材料，本发明优选的是PVC材料的底板。
[0018] 优选地，所述样品垫为玻璃纤维膜。[0019] 优选地，所述结合物垫为玻璃纤维膜、聚酯纤维膜或人造纤维中的任意一种，优选
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为玻璃纤维膜。
[0020] 作为优选技术方案，还包括卡壳盖和卡壳底，所述卡壳盖和卡壳底形成容纳空间，用于容纳所述免疫层析试纸条。[0021] 优选地，所述卡壳上开有加样区3和显色区4。[0022] 在第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的试纸条的制作方法，包括以下步骤：
1)链霉亲和素-金-抗体结合物垫的制备[0024] 调节胶体金溶液的pH值，然后加入甲流标记抗体和链霉亲和素，在室温下振荡反应，然后分两次加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
[0025] 2)金标-生物素结合物垫的制备[0026] 调节胶体金溶液的pH值，然后加入生物素，在室温下振荡反应，然后分两次加入BSA溶液封闭多余的位点，反应并离心后，去掉上清液，将沉淀物进行恢复，将其涂覆在玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；[0027] 3)胶体金免疫层析试纸条的组装[0028] 将羊抗鼠IgG和甲流的包被抗体，分别作为质控线(2)和检测线(1)包被在硝酸纤维素膜上，然后将样品垫、金标-生物素结合物垫，链霉亲和素-金-抗体结合物垫、硝酸纤维素膜和吸水纸依次贴在底板上，并进行组装即可。[0029] 作为优选技术方案，上述步骤1)和步骤2)中，所述胶体金溶液的pH值调整为7.0-9.0，例如可以是7.0、7.1、7.3、7.5、8.0、8.1、8.5，优选为7.1-8.5；更优选为8.5。[0030] 优选地，分两次加入的BSA溶液的浓度分别为10％和1％；[0031] 优选地，所述室温下振荡反应时间为30min；加入BSA溶液封闭位点后的反应时间为0.5-1小时；所述离心时间为30分钟；所述离心转速为10000-12000r/min。[0032] 作为优选技术方案，步骤1)和步骤2)中，所述恢复液包括50mM的NaCl，1％的BSA，0.5％的蔗糖和0.5％的酪蛋白钠。[0033] 在第三方面，本发明提供一种检测甲流抗原的方法，包括如下步骤：[0034] 1)将待测样品加到本发明的胶体金免疫层析试纸条上，免疫层析反应5-10min；[0035] 2)肉眼观察所述试纸条上检测线1和质控线2上胶体金的颜色，得到所述试纸条检测甲流抗原的结果。
[0023]
本发明中，当检测线1和质控线2均显示红色条带时，则说明所述待测样品中含有
甲流抗原。
[0037] 本发明中，如果被检测样品中不含有甲流抗原，样品移动到检测线1处时，不会显示红色条带，只在质控线2处显示红色条带；只要质控线2不显色，即证明该试纸条无效，需要重新检测样品。
[0038] 本发明的基于信号增强的胶体金免疫层析试纸条检测甲流抗原的方法，其原理(图1和图2)在于：
[0039] 在加样区3加入被检测样品后，所滴加的样品经过金标结合物垫，将金-生物素结合物和链霉亲和素-金-抗体结合物释放出来，通过毛细作用，抗原-抗体-金-链霉亲和
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素-生物素-金的结合物向吸水纸一端的方向移动。经过检测线1处的包被抗体时，该抗体可以与抗原发生免疫反应，形成抗体-抗原-抗体-金-链霉亲和素-生物素-金的复合物，因此在检测线1处显示红色条带，样品继续向前流动，经过质控线2处的二抗时，其可以与金上的标记抗体发生免疫反应，形成二抗-抗体-金-链霉亲和素-生物素-金的复合物，因此在质控线2处显示红色条带(图3)；如果被检测样品中不含有甲流抗原，样品移动到检测线1处时，不会显示红色条带，只在质控线2处显示红色条带(图4)；只要质控线2不显色，即证明该试纸条无效(图5)，需要重新检测实际样品。[0040] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：[0041] 1、本发明所述的胶体金试纸条依照抗原和抗体的特异性反应以及链霉亲和素和生物素的特异性反应的原理测定甲型流感病毒的抗原，通过一次性操作即可检测流感抗原，读取结果快捷而直观，10分钟以内即可获得检测结果。[0042] 2、本发明的检测甲流抗原的方法，无需特殊仪器设备，也不需要专业人员的操作，摆脱了对专业仪器的依赖。[0043] 3、与传统的双抗体夹心法相比，本发明的检测方法能够通过信号放大，提高检测灵敏度，可达到6ppb-12.5ppb。[0044] 4、本发明的检测结果的总体符合率较高，可达到100％，适合于现场检测。附图说明
[0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055]
图1是本发明的检测甲流抗原的胶体金试纸条示意图
图2是本发明的检测甲流抗原的原理图图3是检测甲流抗原为阳性的检测结果图4是检测甲流抗原为阴性的检测结果图5是检测甲流抗原无效的检测结果
图6是不同比例的抗体与链霉亲和素对T线灰度值的影响
图7是传统方法检测甲流抗原的结果及其T线灰度值的大小示意图图8是本发明的方法检测甲流抗原的结果及其T线灰度值的大小示意图图9是购买广州万孚和凯必利公司的甲流检测试纸条的检测结果图10是阴性样本的检测结果其中：1-检测线；2-质控线；3-加样区；4-显示区
具体实施方式
[0056] 下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。[0057] 图1是本发明的检测甲流抗原的胶体金试纸条示意图，图2是本发明检测甲流抗原的原理图。[0058] 实施例1[0059] 所用的试剂仪器设备来源：[0060] 1甲型流感，抗原及其抗体：北京沫之东生物技术有限公司；[0061] 2羊抗鼠IgG：北京博奥森生物技术有限公司；
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3链霉亲和素，生物素：北京博奥森生物技术有限公司；[0063] 4硝酸纤维素膜：默克密理博；[0064] 5三维平面划膜仪，三维平面喷金仪：上海金标生物科技有限公司；[0065] 6冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；[0066] 7切条机：上海金标生物科技有限公司；[0067] 8PVC胶板，吸水纸，玻璃纤维膜，卡壳购自上海金标生物科技有限公司。[0068] 甲型流感病毒抗原的检测：[0069] 1、链霉亲和素-金-抗体结合物的制备
[0070] (1)取200μg甲型流感标记抗体置于透析袋中对5mMTris-HCl进行透析24h，在此过程中，每隔2h换一次水，透析完成后，将抗体取出置于离心管中，加入超纯水至2mL。离心后弃去沉淀杂质；
[0071] (2)取40μg左右的链霉亲和素稀释在2mL的去离子水中；[0072] (3)制备链霉亲和素-金-抗体结合物垫：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金，将所用的玻璃仪器事先用洗液过夜浸泡，然后冲洗干净。将烧杯中加入1000mL超纯水，然后加入10mL的1％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL1％的氯金酸溶液，煮沸15min后至冷却，置于4℃保存。颗粒直径大约为20～30nm，取20mL胶体金溶液置于烧杯中，加入450μL0.01M的K2CO3溶液调节溶液的pH，搅拌均匀，然后分别加入离心好的抗原和链霉亲和素，搅拌30min左右，然后加入2mL10％的BSA溶液，进行离心，(30Min，10000rpm)，然后弃去上清液，再加入1％的BSA的溶液(含有1mM的pH8.6的Tris-HCl缓冲溶液)继续离心，弃去上清液，将沉淀物进行恢复，恢复液的成分为：50mM的NaCl，1％的BSA，0.5％的蔗糖，0.5％的酪蛋白钠，将其涂覆在200cm2大小的玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；
[0073] 链霉亲和素-金-抗体结合物的制备时，需要进行抗体和链霉亲和素的比例(按照5:0.5/5:1/5:2/5:3/5:4/5:5)优化实验，通过检测结果(图6)可以看出，当抗体和链霉亲和素的比例为5：1时，本发明的试纸条上检测线1的显色程度最好。[0074] 2、金标-生物素结合物的制备[0075] 制备金标-生物素结合物垫：采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金，将所用的玻璃仪器事先用洗液过夜浸泡，然后冲洗干净。将烧杯中加入1000mL超纯水，然后加入10mL的1％的柠檬酸钠溶液，加热至沸腾后，再加入10mL1％的氯金酸溶液，煮沸15min后至冷却，置于4℃保存。颗粒直径大约为20～30nm，取20mL胶体金溶液置于烧杯中，加入300μL0.01M的K2CO3溶液调节溶液的pH，加入50μg左右的生物素，搅拌30min左右，然后加入2mL10％的BSA溶液，进行离心，(30Min，10000rpm)，然后弃去上清液，再加入1％的BSA的溶液(含有1mM的pH8.6的Tris-HCl缓冲溶液)继续离心，弃去上清液，将沉淀物进行恢复，恢复液的成分为：50mM的NaCl，1％的BSA，0.5％的蔗糖，0.5％的酪蛋白钠，将其涂覆在200cm2大小的玻璃纤维膜上面，-45℃冷冻后，作为结合物垫，冻干后室温避光保存备用；[0076] 3、将羊抗鼠IgG和甲流的包被抗体，分别作为质控线2和测试线1包被在硝酸纤维素膜上，然后将硝酸纤维素膜，吸水纸，金标结合物垫(金标-生物素结合物垫，链霉亲和素-金-抗体结合物垫)和样品垫依次贴在PVC底板上，并进行组装。
[0077] 采用上述组装后的胶体金免疫层析试纸条进行甲流病毒抗原的检测，用PBS配制
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不同浓度的甲流抗原的标准液(1600/800/400/200/100/50/25/12.5/6/0ng/mL)，滴加10分钟之后，读取检测结果，肉眼观察检测该病毒抗原的检测灵敏度最高为6ppb，如图8所示。而图7所示的传统的双抗体夹心法的检测灵敏度为25ppb。[0078] 因此本发明所提出的检测方法能够放大信号，提高检测灵敏度，在实际应用中，对于特定的目标物具有潜在的应用价值。[0079] 实施例2[0080] 将广州万孚生物技术有限公司和凯必利生物技术有限公司的甲型流感胶体金试纸条与本发明的方法进行对比，通过检测不同浓度的甲型流感抗原，结果如图9所示，万孚和凯必利的胶体金试纸条的灵敏度分别为25ppb和50ppb，而本发明的方法的检测灵敏度为12.5ppb，说明本发明的胶体金免疫层析试纸条具有更高的灵敏度。[0081] 实施例3[0082] 将甲流抗原用人的血清进行稀释，模拟实际样品的检测，并稀释不同浓度的溶液。用本发明所制备的试纸条对随意抽查的10份实际样本进行检测。将样本滴在试纸条上，15分钟之后读取结果。结果如图10所示，所抽查检测的10份样本都显示阳性。[0083] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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