*CN102031262A*
(10)申请公布号 CN 102031262 A(43)申请公布日 2011.04.27
(12)发明专利申请
(21)申请号 201010256198.1(22)申请日 2010.08.17
(71)申请人浙江省农业科学院
地址310021 浙江省杭州市石桥路198号(72)发明人徐子伟 刘淑杰 李永明 王一成(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公
司 33200
代理人周烽(51)Int.Cl.
A61P 31/04(2006.01)C12R 1/46(2006.01)C12R 1/225(2006.01)
C12N 15/31(2006.01)C12N 15/63(2006.01)C12N 1/21(2006.01)A61K 39/108(2006.01)A61P 1/12(2006.01)
(54)发明名称
一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法及用途(57)摘要
本发明公开了一种表达faeG的基因工程益
根据已公开的F4大肠生菌的构建方法及用途，
杆菌菌毛粘附素FaeG的基因序列及表达载体质粒特点，设计含特异酶切位点的引物；以产肠毒素性大肠杆菌质粒DNA为模板，进行PCR扩增，获得含有faeG基因的片段，将其与表达载体质粒pNZ8148进行连接，获得重组质粒pNZ8148-faeG，通过电转化方法将该重组质粒转入乳杆菌或乳球菌细胞内，得到表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌，在乳链菌肽(nisin)的诱导下进行表达，并经SDS-PAGE和Western blot分析证明目的基因得到正确表达。该重组菌可用于预防哺乳仔猪和断奶仔猪大肠杆菌性腹泻。
权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页
附图 3 页
CN 102031262 ACN 102031262 ACN 102031265 A
权 利 要 求 书
1/1页
1.一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)获得大肠杆菌粘附素FaeG基因：以产肠毒素性大肠杆菌C83907质粒DNA为模板，设计合成含有Nco I和Xba I酶切位点的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分别具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的基因序列。采用PCR方法扩增faeG目的基因片段。将扩增的faeG目的基因片段与pMD18-T载体连接，得重组质粒，转入大肠杆菌TOP10中，该重组质粒命名为pMD-faeG，其具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。
(2)构建重组表达载体pNZ8148-faeG：将表达载体质粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切，纯化回收双酶切载体片段和目的片段。目的片段和双酶切载体片段连接后转化感受态E.coli MC1061，提取重组质粒，命名为pNZ8148-fae G，其具有SEQ ID NO.2所示的基因序列。
(3)构建表达大肠杆菌粘附素基因faeG的重组乳酸乳球菌：采用电转化方法将重组质粒pNZ8148-faeG转化感受态细胞L.lactis NZ9000，利用氯霉素对转化子进行筛选，得重组菌，命名为NZ9000/8148-faeG，其具有SEQ ID NO.3所示的基因序列。
(4)大肠杆菌粘附素FaeG在乳酸乳球菌中的诱导表达及SDS-PAGE、Westernblot分析：挑取重组菌NZ9000/8148-faeG接种于含有10mg/mL氯霉素的GM17液体培养基中，30℃静置培养过夜。培养物以3％的比例转接于500ml含氯霉素GM17培养液中，培养至OD600＝0.5～0.6时，加入诱导剂nisin，使其终浓度为5ng/ml，继续培养3h。
2.一种权利要求1所述表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌在预防哺乳仔猪和断奶仔猪大肠杆菌性腹泻中的应用。
2
CN 102031262 ACN 102031265 A
说 明 书
一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法及用途
1/5页
技术领域
本发明属于畜牧兽医技术领域，尤其涉及一种表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌构建及其在预防仔猪大肠杆菌性腹泻中的应用。
[0001]
背景技术
由产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的仔
猪腹泻，对养猪生产构成严重威胁，养猪业每年因此而遭受巨大的经济损失。仔猪大肠杆菌性腹泻包括哺乳仔猪腹泻和断奶仔猪腹泻。哺乳仔猪大肠杆菌性腹泻又分为仔猪黄痢和白痢。仔猪黄痢是初生仔猪常发的急性、致死性传染病，主要发生于7日龄以内的乳猪，1～3日龄的乳猪多发，发病后以排黄色或黄白色稀便为特征。猪群一旦发病，很快传播开来，一窝仔猪中的发病率可达50％～100％，死亡率有的可达100％。仔猪白痢多发于10～30日龄的哺乳仔猪，以排灰白色有腥臭味的浆糊样稀便，严重的可排水样稀便为特征。仔猪断奶后大肠杆菌性腹泻多发生于断奶后1周，症状虽不像出生时那么明显，但常减慢仔猪增重速度，其它因素如断奶应激、食物的改变等都会加重病情。[0003] 当仔猪感染ETEC后，ETEC菌毛与小肠粘膜上皮的特异性受体结合，使得ETEC在小肠内定居，大量繁殖，产生耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin，ST)或/和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)。肠毒素侵入小肠上皮细胞内，改变上皮细胞的正常吸收和分泌，扰乱小肠代谢，使水、电解质大量进入小肠腔，从而引起剧烈腹泻。在这个过程中，菌毛和肠毒素被认为是主要的毒力因素，其中菌毛与小肠上皮结合是感染的首要步骤，也是致病的关键环节。不同ETEC菌株的菌毛抗原类型不同，主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41等，在我国最常见的是K88。
[0004] 对于哺乳仔猪大肠杆菌性腹泻的预防，目前已有商业化疫苗可供选择，主要有F4(K88)-F5(K99)二价苗和大肠杆菌灭活苗。用这些疫苗免疫妊娠后期母猪，会在母猪体内产生特异性抗体，仔猪通过吮吸初乳获得母源抗体，从而阻止产肠毒素性大肠杆菌在肠内定居，避免疫病发生；但现有商业化疫苗对仔猪断奶后大肠杆菌性腹泻却难以奏效。此外，商业化的大肠杆菌灭活苗或大肠杆菌基因工程苗，因细菌胞壁含有脂多糖(内毒素)毒性成分，接种动物时会产生较强的副反应。
[0005] F4菌毛的生物合成和组装至少与FaeA-FaeJ 10个蛋白亚基有关。其中FaeG含量最多，系组成菌毛的主要亚基，与菌毛的粘附特性有关，是F4受体的主要结合位点。乳杆菌和乳球菌被视为公认安全(GRAS)的微生物，细胞壁不含脂多糖(内毒素)毒性成分，以其为受体菌构建表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌，用于预防仔猪大肠杆菌性腹泻，具有广阔前景。目前国内在该领域的研究尚属空白。
[0002]
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种表达faeG(产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因)的基因工程益生菌的构建方法及用途，本发明免疫原性好、具有佐剂效应、结
[0006]
3
CN 102031262 ACN 102031265 A
说 明 书
2/5页
构稳定、副作用小、制备简便。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法，该方法包括以下步骤：
[0008] (1)获得大肠杆菌粘附素FaeG基因：以产肠毒素性大肠杆菌C83907质粒DNA为模板，设计合成含有Nco I和Xba I酶切位点的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分别具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的基因序列。采用PCR方法扩增faeG目的基因片段。将扩增的faeG目的基因片段与pMD18-T载体连接，得重组质粒，转入大肠杆菌TOP10中，该重组质粒命名为pMD-faeG，其具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。[0009] (2)构建重组表达载体pNZ8148-faeG：将表达载体质粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切，纯化回收双酶切载体片段和目的片段。目的片段和双酶切载体片段连接后转化感受态E.coli MC1061，提取重组质粒，命名为pNZ8148-fae G，其具有SEQ ID NO.2所示的基因序列。
[0010] (3)构建表达大肠杆菌粘附素基因faeG的重组乳酸乳球菌：采用电转化方法将重组质粒pNZ8148-faeG转化感受态细胞L.lactis NZ9000，利用氯霉素对转化子进行筛选，得重组菌，命名为NZ9000/8148-faeG，其具有SEQ ID NO.3所示的基因序列。[0011] (4)大肠杆菌粘附素FaeG在乳酸乳球菌中的诱导表达及SDS-PAGE、Westernblot分析：挑取重组菌NZ9000/8148-faeG接种于含有10mg/mL氯霉素的GM17液体培养基中，30℃静置培养过夜。培养物以3％的比例转接于500ml含氯霉素GM17培养液中，培养至OD600＝0.5～0.6时，加入诱导剂nisin，使其终浓度为5ng/ml，继续培养3h。
[0012] 一种上述表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌在预防哺乳仔猪和断奶仔猪大肠杆菌性腹泻中的应用。[0013] 本发明的有益效果是：基因工程受体菌乳杆菌和乳球菌是公认安全的微生物，不含内毒素、不分泌外毒素，作为疫苗载体对靶动物和人类安全；构建的基因工程乳杆菌和乳球菌表达目的抗原后，不需经提纯、复性等复杂的后处理过程，可直接使用，疫苗制作简便；乳杆菌和乳球菌自身具有佐剂效应，能增强所表达目的抗原(Fae G)的免疫效果；作为口服疫苗应用时，乳杆菌和乳球菌菌体对所表达的目的抗原(Fae G)起保护作用，抵抗胃肠道逆境的降解破坏，提高免疫效果。附图说明
图1为表达载体质粒pNZ8148图谱；
[0015] 图2为pMD-fae G重组质粒双酶切产物电泳图谱，图中，1为DNA MarkerDL2,000，2为重组质粒经NcoI和XbaI双酶切产生的片段；
[0016] 图3为重组质粒pNZ8148-faeG电转化乳球菌PCR鉴定电泳图谱，图中，1为DL2,000DNA Marker，2-10为重组菌PCR产物；
[0017] 图4为重组质粒pNZ8148-faeG电转化乳球菌提取质粒酶切产物电泳图谱，图中，1为DL2,000DNA Marker，2-4为重组菌提取质粒酶切产物；[0018] 图5为重组菌表达产物的SDS-PAGE电泳图谱，图中，M为蛋白质标准分子量，1为含空白质粒pNZ8148乳球菌，2为含重组质粒pNZ8148-faeG乳球菌；[0019] 图6为重组菌表达产物的Western-blotting图谱，1为大肠杆菌C83907(用于扩
[0014]
4
CN 102031262 ACN 102031265 A
说 明 书
3/5页
增粘附素基因faeG)，2为蛋白质标准分子量，3-4为含空白质粒pNZ8148乳球菌，5为含重组质粒pNZ8148-faeG乳球菌；
[0020] 图7为重组菌免疫小鼠血清FaeG特异性IgG动态变化；[0021] 图8为重组菌口服免疫小鼠粪FaeG特异性SIgA动态变化。
具体实施方式
[0022] 本发明所述表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的重组益生菌采用以下方法构建：根据已公开的F4大肠杆菌菌毛粘附素FaeG的基因序列及表达载体质粒特点，设计含特异酶切位点的引物；以从腹泻仔猪中分离得到或购买的产肠毒素性大肠杆菌质粒DNA为模板，进行PCR扩增，获得含有faeG基因的片段，将其与表达载体质粒pNZ8148进行连接，获得重组质粒pNZ8148-faeG，通过电转化方法将该重组质粒转入乳杆菌或乳球菌细胞内，在乳链菌肽(nisin)的诱导下进行表达。[0023] 其中F4大肠杆菌包括F4ab、F4ac和F4ad 3个血清型；表达载体质粒为pNZ8148或以pNZ8148为基础改变选择标记后获得的质粒；受体菌为染色体上整合有nisK和nisR基因的乳杆菌或乳球菌；用于扩增F4大肠杆菌菌毛粘附素基因faeG片段的上下游引物P1和P2的基因序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示：[0024] P1：CCATGGGGATGACTGGTGATTTCAATG[0025] Nco I[0026] P2：TCTAGAATAAGTAATTGCTACGTTCAG[0027] Xba I
[0028] 乳杆菌和乳球菌被视为公认安全(GRAS)的微生物，属革兰氏阳性菌，细胞壁不含脂多糖(内毒素)毒性成分，并具有促进动物消化道有益菌生长、抑制有害菌繁殖、增强动物免疫功能等多种作用，已作为益生菌饲料添加剂应用于畜禽生产中。本发明构建的表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的重组益生菌，作为疫苗用于仔猪大肠杆菌性腹泻预防，既具有抗原保护、缓释作用又兼具佐剂作用，可取得比现有以大肠杆菌为基础的常规疫苗更好的效果。具体应用方法如下：[0029] 哺乳仔猪大肠杆菌性腹泻：表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的重组益生菌经灭活后以注射途径产前免疫母猪，仔猪通过吮吸初乳获得母源抗体预防哺乳期大肠杆菌性腹泻。
断奶仔猪大肠杆菌性腹泻：表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的重组益
生菌以口服途径接种仔猪，通过激活粘膜免疫应答，产生粘附素FaeG特异性SIgA，与产肠毒素性大肠杆菌菌毛结合从而阻断病菌与猪肠粘膜上皮细胞受体结合，预防断奶仔猪大肠杆菌性腹泻。
[0031] 经过一系列免疫保护试验，证明表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的重组益生菌可有效预防仔猪大肠杆菌性腹泻。
[0032] 下面结合附图举例对本发明做更详细地描述，本发明的目的和效果将变得更加明显。
[0033] 1、生物材料
[0034] (1)目的基因序列
[0030]
5
CN 102031262 ACN 102031265 A[0035]
说 明 书
4/5页
大肠杆菌粘附素FaeG的基因序列来自于国际互联网Genbank中。[0036] (2)载体质粒
[0037] nisin诱导型胞内表达载体质粒pNZ8148来自荷兰NIZO研究所，图谱详见图1。[0038] pMD18-T载体购自上海生物工程技术服务有限公司。[0039] (3)菌株
[0040] 大肠杆菌TOP10购自Invitrogen公司；大肠杆菌E.coli MC1061购自Invitrogen公司；含大肠杆菌粘附素FaeG基因的产肠毒素性大肠杆菌C83907(O149：K91，K88ac)来自中国兽医监察所；受体菌L.lactis NZ9000来自荷兰NIZO研究所。[0041] 2、大肠杆菌粘附素FaeG基因的获得
[0042] 以产肠毒素性大肠杆菌C83907质粒DNA为模板，设计合成含有Nco I和Xba I酶切位点的上下游引物P1和P2，采用PCR方法扩增faeG目的基因片段。将faeG基因PCR产物与pMD18-T载体连接，转入大肠杆菌TOP10中。重组质粒经酶切鉴定(详见图2)和测序(上海英俊生物技术有限公司)分析，证明扩增的目的片段为faeG的完整基因，该重组质粒命名为pMD-faeG，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0043] 上下游引物P1和P2的基因序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。[0044] 3、重组表达载体pNZ8148-fae G的构建
[0045] 将表达载体质粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切，纯化回收双酶切载体片段和目的片段。目的片段和双酶切载体片段连接后转化感受态E.coli MC1061，提取重组质粒经酶切鉴定和测序(上海英俊生物技术有限公司)分析验证后命名为pNZ8148-faeG，其基因序列如SEQ ID NO.2所示。[0046] 4、表达大肠杆菌粘附素基因faeG的重组乳酸乳球菌构建
[0047] 采用电转化方法将重组质粒pNZ8148-faeG转化感受态细胞L.lactis NZ9000，电击条件为电压2500V、电阻400Ω、电容25uF。利用氯霉素对转化子进行筛选，经PCR鉴定(详见图3)、酶切鉴定(详见图4)和测序(上海英俊生物技术有限公司)验证后重组菌命名为NZ9000/8148-faeG，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。[0048] 5、大肠杆菌粘附素FaeG在乳酸乳球菌中的诱导表达及SDS-PAGE、Westernblot分析
[0049] 挑取重组菌NZ9000/8148-faeG接种于含有10ug/mL氯霉素的GM17液体培养基中，30℃静置培养过夜。培养物以3％的比例转接于500ml含氯霉素GM17培养液中，培养至OD600＝0.5～0.6时，加入诱导剂nisin，使其终浓度为5ng/ml，继续培养3h。重组菌裂解后经SDS-PAGE(详见图5)和Western blot(详见图6)分析证明目的基因得到正确表达。重组菌经nisin诱导后，在27.0kD处出现一特异性蛋白条带，与预期的大小一致。凝胶经薄层扫描分析显示，目的蛋白约占受体菌总蛋白的10％。[0050] 6、基因工程疫苗的免疫效果
[0051] 本发明构建的表达大肠杆菌粘附素FaeG的重组乳酸乳球菌，分别采用皮下注射和口服途径免疫小鼠，结果(详见图7、8)表明：(1)注射接种初免后五周血清FaeG特异性IgG效价高于1000，初免后七周血清效价高于4000；(2)口服途径初免后七周，小鼠粪中Fae G特异性sIgA水平显著高于对照组。[0052] 图7中，
6
CN 102031262 ACN 102031265 A[0053]
说 明 书
5/5页
口服对照组，口服低剂量转基因乳球菌组，口服高剂量转基因乳球菌组，联合口服高剂量转基因乳球菌和佐剂组，皮下注射接种组。[0054] 图8中，[0055] 对照组低剂量重组菌组[0056] 高剂量重组菌组，高剂量重组菌和佐剂联合组。
7
CN 102031262 ACN 102031265 A序 列 表
[0001]
8
1/3页
CN 102031262 ACN 102031265 A序 列 表
[0002]
[0003]
9
2/3页
CN 102031262 ACN 102031265 A
序 列 表
3/3页
10
CN 102031262 ACN 102031265 A
说 明 书 附 图
1/3页
图1
图2
11
CN 102031262 ACN 102031265 A
说 明 书 附 图
2/3页
图3
图5
图4
12
CN 102031262 ACN 102031265 A
说 明 书 附 图
3/3页
图6
图7
图8
13
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容