微生物显微技术及微生物计数法

• 在实验室中常用的有:普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

通常在我们观察细菌、放线菌以及真菌等相对较大的微生物时,可以采用普通光学显微镜。普通光学显微镜通常能将物体放1500~2000倍。 八、微生物计数法

• 显微直接计数法：利用血细胞计数板在显微镜下直接计数,能立即得到数值,但死活细胞都计数在内。 • 平板计数法：是平板上长成菌落后再计数,反应较真实,但费时太长。 （一）微生物直接计数法

• 利用血细胞计数板进行直接计数。

• 计数前需对样品做适当稀释,然后将经过适当稀释的菌悬液(或孢子悬液)放在血细胞计数板的计数室内,按照在显微镜下观察到的微生物数目代入计算公式运算后,

即可得出单位体积微生物总数目。 • 此法的优点是直观、快速。

• 用于直接测数的菌悬液浓度一般不宜过低或过高(常大于106个/mL)。活跃运动的细菌应现用甲醛杀死或适度加热以停止其运动。

• 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质,常不易分辨。

• 菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。 • 两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部的细菌不易看清。

• 每个方格网共分九个大方格,中间的方格即为计数区。 • 计数区分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格，即计数区都由400个小方格组成。

• 每毫升菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数(N)× 系数(Κ )× 菌液稀释倍数(d)。 系数K=400×

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血细胞计数板的便用

(1)稀释菌液：根据待测菌悬液浓度,加无菌水适当稀释,目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有4~5个酵母细胞为宜,一般稀释100倍即可。

(2)准备计数板：取清洁干燥的血细胞计数板(使用前可通过显微镜检验计数板上有无污物,若有,则需清洗后才能进行计数),在的计数室上加盖专用的盖玻片。

(3)加样：将稀释后的酵母菌悬液摇匀,用滴管吸取一滴置于盖玻片的边缘(不宜过多),让菌悬液沿缝隙靠毛细渗透作用缓缓渗入计数室,勿使气泡产生,并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。 也可以将菌悬液直接滴加在计数区上,不要使计数区两边平台沾上菌悬液,以免加盖盖玻片后,造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片(勿使气泡产生)。

(4)计数：静置片刻(一般为5~10min ,使酵母菌全部沉降到血细胞计数室内。将血细胞计数板置于载物台上夹稳,先在低倍镜下找到计数室后,再换成高倍镜观察并计数。 由于活细胞

在显微镜下是透明的,光照强度过大时难以辨别,所以观察时应减弱光照的强度 计算公式

血细胞计数板的清洗与保藏

(1)血细胞计数板使用后,取下盖玻片,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格刻度。洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。

(2)计数板冲洗后,还要通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净,则必须重复清洗直到干净,干燥后方可放入盒内保存。

（二）稀释平板计数法(或活菌计数法)

在理论上可以认为在高度稀释条件下的每一个活的单细胞均能繁殖成一个菌落,因而可以用培养的方法使每个活细胞生长成一个单独的菌落,并通过长出的菌落数去推算

菌悬液中的活菌数。缺点是比较麻烦,费工费时,而且在混合微生物样品中只能测定占优势的并能在供试培养基上生长的类群,测定值常受各种因素的影响。 一般细菌的平板菌落计数以30~300个为宜

（三）最大可能数计数法又称液体稀释培养计数法。 • 本法适用于测定在一个混杂的微生物群中虽不占优势,但却具有特殊生理功能的类群。

• 其特点：是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰,并通过该生理功能的表现来判断该群微生物的存在和丰度。

• 本法特别适合于测定土壤微生物中特定生理群(如氨化菌、硝化菌、纤维素分解菌、自生固氮菌、根瘤菌、硫化细菌和反硫化细菌等)的数量和检测牛奶及其他食品中特殊微生物类群的数量。

• 其缺点是只能进行特殊生理群的测定,结果偏差较大 （四）比浊法

原理：根据在一定的浓度范围内,菌悬液中的微生物细胞浓度

与液体的光密度成正比,与透光度成反比。 可使用光电比色计测定。

由于细胞浓度仅在一定范围内与光密度成直线关系,因此,待测菌悬液的细胞浓度不应过低或过高,培养液的色调也不宜过深,颗粒性杂质的数量应尽量减少。

本法常用于观察和控制在培养过程中微生物的菌数消长情况。如,细菌生长曲线的测定和发酵罐中的细菌生长量控制等。其优缺点与直接测数法相同。 （五）浓缩法(膜过滤法)

本法适用于检测微生物数量很少的水和空气等样品。测定时让定量的水或空气通过特殊的微生物收集装置(如微孔滤膜等),富集其中的微生物,然后将滤膜干燥、染色,并经处理使膜透明,再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数。或将收集的微生物洗脱后测数,再换算成原来水或空气中的数量。