HPLC测定中药百合中2个甾体皂苷的含量

傅春燕;刘永辉;李明娟;王晓慧;尹文清

【摘 要】首次建立百合中2个甾体皂苷的高效液相色谱含量测定方法.采用Shim-pack VP-ODS (4.6 mm×250mm,5μm)色谱柱,甲醇-水梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长205 nm.化合物1和2的线性范围及相关系数分别为:1.03 ～10.30ug(r=0.9998)和1.26～12.56 μg(r=0.9999)；平均回收率分别为100.59％和99.97％.该方法操作简便,结果准确,重现性好,可用于百合中2个甾体皂苷的含量测定,为建立和完善中药百合药材的质量控制方法提供依据.%A method was established for determining two steroidal saponins (compounds 1 and 2) in lilium brownii by HPLC for the first time. Separation was achieved by A Shim-pack VP-ODS column (4. 6 mm x250 mm,5 μm ) using acetonitrile and water (containing 0.1% phosponic acid) as the mobile phase with gradient elution at the flow rate of 1. 0 mL/min, column temperature at 30 ℃ and the wavelength of UV detection was 205 nm. There were good linear correlations between the studied concentrations of the two steroidal saponins and their chromatographic peak areas,and the correlation coefficients were 0. 9998-0.9999. The recoveries of two steroidal saponins were 100.59 and 99.97% .respectively. The RSD of precision and accuracy was less than 3%. The determination results of three batch samples showed that the method was simple,accurate and could be used in the quantitative determination of two components in the Lilium brownie. 【期刊名称】《天然产物研究与开发》

【年(卷),期】2012(024)009 【总页数】4页(P1250-1252,1256)

【关键词】百合;甾体皂苷;高效液相色谱;含量测定 【作 者】傅春燕;刘永辉;李明娟;王晓慧;尹文清

【作者单位】邵阳医学高等专科学校;湖南省新邵县红十字会医院,邵阳422000;邵阳医学高等专科学校;邵阳医学高等专科学校;广西师范大学化学化工学院药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室,桂林541004 【正文语种】中 文 【中图分类】R917

百合(Lilium browni)为百合科多年生草本植物，其地下鳞茎部位可药食两用。据医药典籍《本草纲目》记载，百合味甘、微苦、性平，具有补益心肺、固肾、补脑、清心、安神、镇静、清润肺燥、调理脾胃、益气调中、清热止咳、养阴止血、消暑等功效［1］。药理研究表明百合具有滋阴、润肺、增强肌体免疫、抗肿瘤、降血糖、抗氧化活性等功效［2，3］，临床用百合及以百合为主药治疗燥咳、精神分裂症、更年期综合症、糖尿病等［2］。百合鳞茎主要含有甾体皂苷类化合物［4-6］。在前期研究中，笔者从百合醇提物中分离得到两个甾体皂苷，26-O-β-D-吡喃葡萄糖-3β，26-二羟基-5-胆甾烯-16，22-二氧3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)和26-O-β-D-吡喃葡萄糖-3β，26-二羟基-5-胆甾烷-16，22-二氧3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)。本文采用高效液相色谱对中药百合中化合物1和2进行了含量测定，以实现对百合药材较为全面的

质量控制。 1 仪器与试剂

岛津Prominence LC-20A高效液相色谱系统，双波长紫外检测器，岛津 LCsolution色谱工作站;Sartorious BT 25S型1/100 000电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);2500DE型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。2个甾体皂苷均为自制(实验室自制，经UV，NMR，MS，IR鉴定，HPLC纯度不低于98%)，符合定量要求。乙腈(色谱纯);水为屈臣氏蒸馏水;其他试剂均为分析纯。中药百合由湖南康尔佳中药饮片厂提供，药材由广西师范大学生命科学院唐绍清教授鉴定为百合科百合属植物百合(Lilium brownii F.E.Brown var.viriulum baker)地下鳞茎部分。 2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 供试品溶液的制备

百合干燥鳞茎1.0 g用30 mL 70%甲醇超声(功率:140 w，频率:42 KHz)提取60 min，即得百合药材甲醇提取物，置100 mL量瓶中，加流动相超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，备用。 2.1.2 供试品处理的正交实验

采用正交试验L9(34)进行百合药材的甲醇超声提取工艺研究，以化合物1和2的含量为评价指标，选择甲醇浓度(60%，80%，100%)、料液比［1∶30，1∶40，1∶50(g/mL)］、超声时间(20 min，40 min，60 min)3个因素，每个因素设3个水平。结果表明，各因素对2种成分的总含量影响顺序为甲醇浓度＞料液比＞超声时间，确定最佳提取工艺为70%甲醇30倍量，超声处理60 min。 精密称取百合3份，每份1.0 g，按照上述最佳工艺进行超声提取，并按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件下精密吸取10 μL进样分析。结果表明，本法

的提取效果较好，见表1。

表1 化合物1和2的验证实验结果Table 1 Verification results of compounds 1 and 21 2序号No. Content(%) RSD/% 含量(%) Content(%)含量(%)RSD/% 1 0.028 0.046 2 0.027 2.11 0.047 2.17 3 0.027 0.045 2.1.3 对照品溶液的制备

精密称取对照品化合物1和化合物2适量，用流动相配置成质量浓度分别为:0.515 mg/mL和0.628 mg/mL的对照品溶液，备用。 2.2 色谱条件及系统适应性实验

色谱柱:Shim-pack VP-ODS色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%H3PO4水溶液(B)梯度洗脱，29%～30%A(0～15 min);流速:1 mL/min;检测波长:205 nm;柱温:30℃。依上述色谱条件，分别精密吸取化合物1和化合物2两种对照品溶液和供试品溶液各10 μL，分别进样。分别精密吸取化合物1、化合物2对照品溶液及供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图(图1)。结果表明，在“2.2”色谱条件下，样品中化合物1和化合物2的色谱峰与其他组分分离良好，对照溶液及样品溶液主峰的保留时间一致。理论塔板数以化合物1计不低于5000。

图1 对照品和供试样品的HPLC色谱图(A-化合物1;B-化合物2;C-供试样品)Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substances and sample(A-compound 1;B-compound 2;C-sample) 2.3 线性关系考察

在“2.2“项的色谱条件下，分别精密吸取化合物1和化合物2对照品溶液2、4、6、8、10、12和20 μL，注入液相色谱仪，记录各色谱峰峰面积。以对照品量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。化合物1和2的线性方程，线性范围和相关系数见表1。

2.4 精密度考察

取百合鳞茎甲醇提取物，按“2.1”项下方法，制备供试品溶液。在“2.2”项的色谱条件下，精密吸取供试品溶液10 μL，连续进样6次，测定化合物1和化合物2色谱峰峰面积的RSD分别为1.01%和0.83% ，表明仪器的精密度良好。 2.5 稳定性考察

取“2.4”项下供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定1和2的色谱峰峰面积，RSD分别为1.13%和1.45%。表明样品在24 h内基本稳定。 2.6 重复性考察

取百合鳞茎甲醇提取物，精密称定6份，按“2.1”项下方法法，制备供试品溶液，平行测定峰面积。计算得1和2的RSD分别为2.44%和1.96%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率考察

称取“2.6”项下的同一批百合鳞茎甲醇提取物6份(含1 0.028%，2 0.041%)，每份1.5000 g，精密称定，分别精密加入化合物1和化合物2对照品溶液适量，依法制备样品，并按照“2.2”项下色谱条件测定，计算回收率。结果见表2和表3。

2.8 样品含量测定

精密称取3批百合鳞茎甲醇提取物各3份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进行测定。以外标法计算各成分的含量。结果见表4。 3 讨论

表2 化合物1加样回收率考察结果(n=6)Table 2 Recovery of compound 1 in the samples(n=6)样品Sample(g) 1(mg)加入量Added quantity (mg)测得量Total quantity (mg)回收率Recovery (%) RSD(%) 1.5021 0.4206 0.4120

0.8301 99.40 1.5003 0.4201 0.4120 0.8398 101.87 1.4991 0.4197 0.4120 0.8275 98.98 1.5013 0.4204 0.4120 0.8293 99.25 1.51 1.4998 0.4199 0.4120 0.8401 101.99 1.5008 0.4202 0.4120 0.8407 102.06

目前，测定中药材中皂苷类物质的方法研究上，采用高效液相色谱法可以克服传统方法(例如比色法、重量法等)带来的误差大，重复性不好等诸多缺点。本文首次建立了百合中2种甾体皂苷的高效液相色谱分析方法，为百合药材的质量控制提供依据。

表3 化合物2加样回收率考察结果(n=6)Table 3 Recovery of compound 2 in the samples(n=6)样品Sample (g) 2(mg)加入量Added quantity (mg)测得量Total quantity (mg)回收率Recovery (%) RSD (%) 1.5011 0.6155 0.5024 1.1183 100.08 1.5024 0.6160 0.5024 1.1206 100.44 1.4997 0.6149 0.5024 1.1087 98.29 1.4988 0.6145 0.5024 1.1071 98.05 1.37 1.5006 0.6152 0.5024 1.1245 101.37 1.5031 0.6163 0.5024 1.1231 100.88

表4 3批样品含量测定结果(%;n=3)Table 4 Determination results of the three batch samples(%; n=3)1 2批次Batch Content(%) RSD/% 含量(%)

Content(%)含量(%)RSD/% 1 0.026 1.13 0.042 0.99 2 0.028 1.08 0.044 1.24 3 0.029 0.96 0.039 1.17

试验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水及乙腈-磷酸水体系。结果表明，在乙腈-0.1%磷酸水流动相体系中，2种成分分离良好，且无干扰，故选择该流动相体系。实验结果表明，采用HPLC法，在本文建立的色谱条件下，可测定百合药材中2种甾体皂苷的含量，所测成分色谱峰与其它成分分离良好，方法简便快速，结果准确可靠，可作为其质量控制方法之一。 参考文献

【相关文献】

1 Wu XB(吴晓斌)，Ren FL(任凤莲)，Qiu CG(邱昌桂)，et al.Extraction of saponins from Lilium browni and its scavenging effect on hydroxyl radical.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2005，17:777-780.

2 Guo ZH(郭朝晖)，Jiang SX(蒋生祥).Research and application of lily.Acta Chin Med Pharmacol(中医药学报)，2004，32(3):27-29.

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5 Hou XY(侯秀云)，Chen FK(陈发奎).Studies on chemical constituents of Lilium browni.Acta Pharm Sin(药学学报)，1998，33:923-926.

6 Yang XW(杨秀伟)，Cui YX(崔育新)，Liu XH(刘雪辉). NMR characteristics of lililancifoloside A and steroidal saponins.Chin J Mag Reson(波谱学杂志)，2002，19:301-308.