沈阳医学院学报Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ第ｌ０卷第４期２００８年１２月 ・２０５・ 卵巢颗粒细胞体外培养体系的建立及ＤＥＨＰ、ＭＥＨＰ对其增殖 功能的影响 张玉敏，马明月，段志文，裴秀丛，苏芯 （沈阳医学院公共卫生学院毒理学教研室，辽宁沈阳ｌ１００３４） ［摘要］目的：建立卵巢颗粒细胞的原代培养体系，探讨邻苯二甲酸二（２一乙基）己酯（ＤＥＨＰ）及其活性中间产物邻苯二 甲酸单（２一乙基）己酯（ＭＥＨＰ）对原代培养的卵巢颗粒细胞增殖作用的影响。方法：选用２１～２５日龄未成年雌性Ｗｉｓｔａｒ大 鼠，皮下注射孕马血清（ＰＭＳＧ），４８ｈ后断头处死，收集卵巢颗粒细胞，在ＤＭＥＭ—Ｆ１２培养液中培养。卵巢颗粒细胞原代 培养体系建立成功后分别将不同剂量的ＤＥＨＰ（ Ｍ、５ＩｘＭ、２５ｐＬＭ、５０ｌｘＭ、１００￣Ｍ）和ＭＥＨＰ（１ Ｍ、５ Ｍ、２５ Ｍ、 ５０１ｘＭ、１００ｐ￣Ｍ）作用细胞２４ｈ及４８ｈ，以ＣＣＫ一８法检测细胞增殖情况。结果：ＤＥＨＰ作用卵巢颗粒细胞２４ｈ时， １ＩｘＭ ＤＥＨＰ和１００Ｉ￣Ｍ ＤＥＨＰ均能明显抑制卵巢颗粒细胞增殖，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＤＥＨＰ作用卵巢颗粒细胞 ４８ｈ时，】￣ＭＤＥＨＰ和１００ｐ，ＭＤＥＨＰ均能明显促进卵巢颗粒细胞增殖，差异有统计学意义（Ｐ＜０。０５）。而ＭＥＨＰ作用卵巢 颗粒细胞２４ｈ及４８ｈ，ＭＥＨＰ各染毒剂量组均无统计学差异（Ｐ＞０．０５）。结论：ＤＥＨＰ能促进卵巢颗粒细胞增殖，并且和 作用时间长短有关。ＭＥＨＰ在观察剂量下，尚未显示有促进卵巢颗粒细胞增殖的作用。 ［关键词］ＤＥＨＰ；ＭＥＨＰ；细胞增殖；卵巢颗粒细胞 ［中图分类号］Ｒ９９４．６ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１００８—２３４４（２００８）０４—０２０５—０３ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉ－（２－ｅｔｈｙｌｈｅｘｙ１） ｐｈｔｈａｌａｔｅ ａｎｄ ｍｏｎｏ－（２一ｅｔｈｙｌｈｅｘｙ１）ｐｈｔｈａｌａｔｅ ｏｎ ｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ＺＨＡＮＧ Ｙｕ—ｍｉｎ，ＭＡ Ｍｉｎｇ－ｙｕｅ，ＤＵＡＮ Ｚｈｉ—ｗｅｎ，ＰＥＩ Ｘｉｕ—ｅｏｎｇ，ＳＵ Ｘｉｎ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １ １００３４，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｂｕｉｌｄ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｐｙ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒａｔｓ，ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉ一（２一 ｅｔｈｙｌｈｅｘｙ１）ｐｈｔｈａｌａｔｅ ａｎｄ Ｍｏｎｏ一（２－ｅｔｈｙｌｈｅｘｙ１）ｐｈｔｈａｌａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：２１—２５ ｄａｙｓ Ｗｉｓ— ｔｅｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＭＳＧ，ａｔｆｅｒ ４８ｈ ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＤＭＥＭ— Ｆ１２．Ａｆｔｅｒ ｒａｔ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ，ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｏｓｅｓ ｏｆ １ Ｍ、５ Ｍ、２５ Ｍ、５０１ｘＭ、ｌＯＯｐ￣Ｍ ＤＥＨＰ ａｎｄ １ Ｍ、５ Ｍ、２５ＩｘＭ、５０１ｘＭ、１００￣Ｍ ＭＥＨＰ ｆｏｒ ２４ｈ ｏｒ ４８ｈ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＣＣＫ一 ８ ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ １ Ｍ ａｎｄ １００ｐ．Ｍ ＤＥＨＰ ｆｏｒ ２４ｈ，ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜ ０．０５）．Ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ １ Ｍ ａｎｄ １００ｔｘＭ ＤＥＨＰ ｆｏｒ ４８ｈ，ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）．Ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ＭＥＨＰ ｏｒｆ ２４ｈ ａｎｄ ４８ｈ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅ（Ｐ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＤＥＨＰ ｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｄｏｓｅｓ ｏｆ ＭＥＨＰ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆ－ ｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ＤＥＨＰ；ＭＥＨＰ；ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｏｖａｒｉａｎ ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ 大鼠卵巢颗粒细胞培养方法的研究始于二十 世纪七十年代初，经不断改进、完善，现已成为 研究生殖生理和内分泌等的一种重要手段 。近 生殖毒性研究中重要的实验系统。邻苯二甲酸二 （２一乙基）己酯（ＤＥＨＰ）作为聚氯乙烯（ＰＶＣ）等塑料 制品的增塑剂，被广泛应用于食品包装材料、容 器、医疗用品、化妆品及人造革等制造行业。由 年来开始用于生殖毒理学的研究，特别是在毒作 用机制研究上有良好的应用前景，可能成为雌性 于在产品的加工过程中，ＤＥＨＰ并未聚合到ＰＶＣ 高分子的碳链上，因此，随着时间的推移，可不 ［基金项目］国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３０８７２１４１）；沈阳医学 院优秀人才基金资助（Ｎｏ．２００７３０２８） ［作者简介］张玉敏（１９６３一），女（回），高级实验师．研究方 向：生殖毒理学． 断释放出来。ＤＥＨＰ在环境中难以降解，在土壤， 水域，空气及大气沉降物中广泛存在，已造成全 球性的环境污染，并可在自然界生态系统内通过 沈 阳 医 学 院 学 报 第１０卷 食物链在生物体内富集，从而对人类的健康造成 危害，有学者将其描述为产量最大的人类制造的 环境污染物之一ｌ２ Ｊ。由于女性特殊的生理特点和 生活习惯，ＤＥＨＰ暴露的机会明显高于男性，因而 引起了人们对ＤＥＨＰ与女性生殖健康的关注。动 物实验结果表明２ｇ／ｋｇ ＤＥＨＰ染毒具有正常排卵周 期的成熟雌性大鼠５天，可导致大鼠自然排卵周 期改变，动情周期延长，受试大鼠卵泡体积减少， 而卵泡体积减少是由于卵泡颗粒细胞变小的结果， 作用位点主要是卵巢颗粒细胞 』。Ｍａ等研究表明 青春期前雌性大鼠ＤＥＨＰ吸人暴露可影响青春期 发育和生殖功能 。ＭＥＨＰ是ＤＥＨＰ的活性代谢 产物。Ｌｏｖｅｋａｍｐｌ５ 等人研究了ＭＥＨＰ对卯巢颗粒 细胞的影响，发现它可以导致颗粒细胞中作为雄 激素向雌激素转化的限速酶一芳香化酶ｍＲＮＡ水 平的下降。本次实验通过建立卵巢颗粒细胞的原 代培养体系，检测ＤＥＨＰ及ＭＥＨＰ对原代培养的 卵巢颗粒细胞的增殖功能的影响，进一步探讨ＤＥ— ＨＰ及ＭＥＨＰ的雌性生殖毒性的机制。 １材料与方法 １．１实验动物２１～２５日龄幼年Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体 重５０～７０ｇ，由沈阳医学院实验动物中心提供。 １．２主要试剂邻苯二甲酸二（２一乙基）己酯（ＤＥ— ＨＰ），纯度：９９％，ＣＡＳ １１７—８１—７，购于ＳＩＧＭＡ公 司；邻苯二甲酸单（２－乙基）己酯（ＭＥＨＰ），纯度： ９０％，批号ＡＢ１４１０２０，购于ＡＢＣ－Ｒ公司；二甲基 亚砜（ＤＭＳＯ），纯度：９９．５％，批号０５６Ｋ０１７２， 购于ＳＩＧＭＡ公司；ＤＭＥＭ．Ｆ１２培养基，批号： ＮＲＪ００２２，购于海克隆生物制品有限公司；小牛血 清购于中国科学院生物工程研究所；ＣＣＫ一８试剂 购于日本同仁化学研究所；孕马血清购于上海市 计划生育科学研究所。 １．３主要仪器ＣＯ：培养箱，型号：３１１０ ｓｅｒｉｅｓ， 购于Ｔｈｅｒｍｏ电子公司；酶标仪，型号：ＳＰＥＣＴＲＡ ｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４，购于美国ＭＤ公司；超净工作台， 型号：ＨＤ．１３６０，购于北京东联哈尔仪器制造有限 公司；倒置显微镜，型号：ＸＳＺ—Ｄ２，购于重庆光 学仪器厂。 １．４细胞的原代培养取１０只２ｌ～２５日龄未成 年雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，皮下注射ＰＭＳＧ １０ ＩＵ／只， ４８ｈ后断头处死。在无菌条件下立即取出卵巢，刺 破其表面的成熟卵泡，使ＧＣ释放入４℃的ＤＭＥＭ 培养液中，过滤后离心收集细胞，用ＰＢＳ洗２次 后加入ＤＭＥＭ—Ｆ１２培养液（含ｌＯ％小牛血清＋ １００Ｕ／ｍｌ青、链霉素）重悬细胞，０．４％台盼蓝染 色计数。经台盼蓝染色表明，细胞存活率＞９０％。 将细胞种入２４孔培养板中（培养板孔内先涂布多 聚赖氨酸），每孔１０１ｘｌ含细胞３．０×１０ 个／ｍｌ，在 ３７％、５％ＣＯ 温箱中预培养２４ｈ。经预培养后， 细胞可贴壁生长。 １．５卵巢颗粒细胞的鉴定细胞培养４８ｈ后，用 ０．１％胰酶消化，制成单细胞悬液，用ＰＢＳ冲洗２ 次，４％多聚甲醛固定１０ｒａｉｎ，ＨＥ染色可见细胞形 态完整，呈多角形，核呈深蓝色，胞浆淡红色并 含有许多颗粒，确认为卵巢颗粒细胞。 １．６细胞传代培养及实验前处理用含１０％小牛 血清的ＤＭＥＭ－Ｆ１２培养液培养卵巢颗粒细胞，条 件为５％ＣＯ，、３７％。吸出培养液，加入ＰＢＳ清 洗，然后加入０．１％胰酶消化，３７℃孵育３ｒａｉｎ， 加入等体积含血清培养液终止胰酶反应，用吸管 吹打成细胞悬液；转移至离心管离心（１５００ｒｐｍ， ５ｒａｉｎ），再用无血清的ＤＭＥＭ．Ｆ１２培养液调整细胞 浓度为１ Ｘ １０ ／ｍｌ，接种于９６孑Ｌ板（１Ｏ０ ｌ／／孑Ｌ）， 置于３７％、５％ＣＯ 饱和湿度培养箱内培养２４ｈ。 １．７实验分组及处理直接将药液加人培养好的 卵巢颗粒细胞中，观察不同剂量的ＤＥＨＰ和ＭＥＨＰ 分别加入各孔中，每孔加入１０ ，终浓度为１ Ｍ、 ５ Ｍ、２５ＩｘＭ、５０ｔｚＭ和１００ｔｘＭ，同时设等体积的 ０．１％ＤＭＳＯ阴性对照组，每个剂量复设六孔，２４ｈ 及４８ｈ后检测指标。 １．８细胞增殖实验（ＣＣＫ一８法） 实验终点在每 个孔内加入ｌ０ 的ＣＣＫ一８试剂，把培养板放在培 养箱内继续培养１—４ｈ，然后在酶标仪上于４５０ｎｍ 波长处测定各孔ＯＤ值。 １．９统计学方法 应用Ｅｘｃｅｌ软件建立数据库， 数据以均数４－标准差（ ４－ｓ）表示，并采用统计 软件ＳＰＳＳ１０．０进行单因素方差分析（Ｏｎｅ—ｗａｙ ＡＮＯＶＡ），组问两两比较用ＳＮＫ检验，ｔ检验；Ｐ ＜０．０５有统计学意义。 ２结果 ２．１卵巢颗粒细胞原代培养及鉴定（图１、２） 由图ｌ、２可见，ＨＥ染色细胞形态完整，呈多角 形，核呈深蓝色，胞浆淡红色并含有许多颗粒。 此细胞即为卵巢颗粒细胞。 ２．２ ＤＥＨＰ对卵巢颗粒细胞增殖的影响（表１） 第４期‘ 张玉敏等．卵巢颗粒细胞体外培养体系的建立及ＤＥＨＰ、ＭＥＨＰ对其增殖功能的影响 基本能够维持正常生理功能，但通过计数细胞， 发现细胞的数量比较少，其原因可能是由于卵巢 颗粒细胞形态较大，很容易铺满培养瓶，故建议 用大容量培养瓶传代培养。 ＤＥＨＰ的雌性生殖毒性作用主要是通过其代谢 产物单．（２．乙基己基）邻苯二甲酸酯（ＭＥＨＰ）影响 卵巢功能 ｊ，作用位点主要是卵巢颗粒细胞。体 外试验表明，在卵巢颗粒细胞培养时，加入ＭＥＨＰ 图１低倍镜下卵巢颗粒细胞的形态（１０×１０） 图２低倍镜下卵巢颗粒细胞的形态（１０×４０） 表１ ＤＥＨＰ作用卵巢颗粒细胞２４ｈ和 ４８ｈ细胞增殖情况（ ±５） 与对照组比较，１）Ｐ＜０．０５ 与对照组比较，在２４ｈ和４８ｈ时，１ Ｍ ＤＥＨＰ 和１００￣Ｍ ＤＥＨＰ均明显抑制卵巢颗粒细胞增殖， 差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。 ２．３ ＭＥＨＰ对卵巢颗粒细胞增殖的影响（表２） 表２ ＭＥＨＰ作用卵巢颗粒细胞２４ｈ细胞增殖情况（ ４－Ｓ） 与对照组比较，在２４ｈ和４８ｈ时，ＭＥＨＰ各染毒剂量组均无统 计学差异（Ｐ＞０．０５）。 ３讨论 本研究显示，卵巢颗粒细胞在体外生长良好， 可使类固醇合成能通路中芳香化酶的绝对量和活 性改变 Ｊ。然而，本实验的研究结果表明ＭＥＨＰ 作用卵巢颗粒细胞，不能使卵巢颗粒细胞良好增 殖，因此，ＭＥＨＰ的增殖适宜浓度和时间尚须进一 步探讨。 Ｔｒｅｉｎｅｎ等 也发现了ＤＥＨＰ可影响颗粒细胞 的功能，降低ＦＳＨ刺激颗粒细胞Ｃ—ＡＭＰ的生成 量，抑制孕激素生成。本实验的研究结果亦表明 ＤＥＨＰ作用卵巢颗粒细胞，可使卵巢颗粒细胞良好 增殖。 参考文献： ［１］张天宝，杨在昌，李红霞，等．大鼠卵泡颗粒细胞体外实验 方法的建立［Ｊ］．卫生毒理学杂志，１９９４，８（３）：２０３—２０４． ［２］Ｌａｔｉｎｉ Ｇ，Ｖｅｒｒｏｔｔｉ Ａ，Ｄｅ Ｆｅｌｉｃｅ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｄｉ－２－ｅｔｈｙｌｈｅｘｙｌ ｐｈｔｈａｌａｔｅ ａｎｄ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ：ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒ— ｇｅｔｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｎｄｏｃｒ Ｍｅｔａｂｏｌ Ｄｉｓｏｒｄ，２００４，４（１）：３７—４Ｏ． ［３］Ｄａｖｉｓ ＢＪ，Ｍａｏｍｐｏｔ ＲＲ，Ｈｅｉｎｄｅｌ ＪＪ．Ｄｉ・（２－ｅｔｈｙｌｈｅｘｙ１）ｐｈｔｈａｌａｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｓｔｒａｄ—ｉｏｌ ａｎｄ ｏｖｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｙｃｌｉｎｇ ｒａｔｓ． ［Ｊ］Ｔｏｘｉｅｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９４，１２８：２１６—２２３． ［４］Ｍａ Ｍ，Ｋｏｎｄｏ Ｔ，Ｂａｎ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆｐｒｅｐｕｂｅｒｔａｌ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔｓ ｔｏ ｉｎｈａｌｅｄ Ｄｉ－（２－ｅｔｈｙｌｈｅｘｙ１）ｐｈｔｈａｌａｔｅ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｐｕｂｅｒｔｙ ａｎｄ ｐｏｓｔｐｕｂｅｒｔａｌ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉ— ｅｎｃｅｓ，２００６，９３（１）：１６４—１７１． ［５］Ｌｏｖｅｋａｍｐ ＴＮ，Ｄａｖｉｓ ＢＪ．Ｍｏｎｏ一（２－ｅｔｈｙｌｈｅｘｙ１）ｐｈｔｈａｌａｔｅ ｓｕｐ— ｐｒｅｓｓｅｓ ａｒｏｍａｔａｓｅ ｔｒａｎｓ－ｃｒｉｐｔ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌ— ｔｕｒｅｄ ｒａｔ ｇｒｎａｕｌｏｓｅ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００１， １７２：２１７—２２４． ［６］王玉邦，王心如．邻苯二甲酸酯类生殖内分泌毒性［Ｊ］．环 境与职业医学，２００３，２０（６）：４５７—４６０． ［７］Ｄａｖｉｓ ＢＪ，Ｗｅａｖｅｒ Ｒ，Ｇａｉｎｅｓ ＬＪ．Ｍｏｎｏ一（２－ｅｔｈｙｌｈｅｘｙ１）ｐｈｔｈａｌａｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＦＳＨ－ｃＡＭＰ ｓｔｉｍｕｌａ・・ ｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔ ｇｒａｎｕｌｏｓｅ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｅｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９４， １２８（２）：２２４—２２８． ［８］Ｋｈｕｒａｎａ Ｓ，Ｒａｎｍａｌ Ｓ，Ｊｏｎａｔｈａｎ ＮＢ．Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ ｎｅｗｂｏｒｎ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｒａｔｓ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｌａ ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ ｄｅｌａｙｅｄ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｈｙｐｅｒｐｒｏｌａｃｔｉｎｅｍｉａ ａｎｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ［Ｊ］．Ｅｎｄｏｃｉｒｎｏｌｏｇｙ，２００５，１４１（１０）：４５１２—４５１７． ［收稿日期］２００８—０８—２８