常用DNA酶的总结.

本酶催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，（将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶，常用于基因工程，将目的基因连在质粒载体上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键），需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。

T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链

DNA粘性末端或平头末端。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA 5'-磷酸末端和3'-羟基末端间的连接。还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。以上反应均需消耗ATP。

粘末端的连接反应: 插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2-6之间最好，低于2:1就会导致较低的连接效率，高于6:1则会导致多个插入。摩尔比请按载体与插入片段 DNA浓度及分子大小来计算。平滑末端的连接反应：平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端量的2～5倍左右。

与粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果。 (0.05-0.1 μg／ul以上)。反应温度：该酶的最适温度为37℃，由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16℃下进行。若反应1-2小时左右的话也可在室温下进行反应。

抑制剂：T4 DNA连接酶要求Mg 2+，因此螯合Mg 2+的EDTA 的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的 DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。

2. T4 DNA聚合酶：

T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以依赖于DNA模板对5' 端突出末端进行补平；同时可对3' 端突出末端进行削平。也可以在结合有引物的单链DNA模板上，从5'→3'方向催化DNA合成反应。

　　特点：T4DNAPolymerase由于同时具有5'→3' DNA聚合酶活性和

3'→5' DNA外切酶活性（但不具有5'→3'外切酶活性），可以用于将5'端突出末端补平、3'端突出末端削平。T4DNAPolymerase的3'→5' 外切酶活性比Klenow Fragment要高约200倍。

用途：T4DNAPolymerase可用于催化以下反应：DNA5' 或3' 突出末端的平滑化；通过置换反应进行标记DNA探针合成；定点突变过程中第二链的合成；不依赖于连接反应的PCR产物克隆。　　活性定义：37℃ 30分钟时间内，催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)掺入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。

反应方法：例如，酶切完成后，没有进行任何处理，直接加入一点T4 DNA聚合酶、dNTP和BSA，37°C 10min。

　　失活或抑制：70℃加热10分钟可使T4 DNAPolymerase失活。金属离子螯合剂可以抑制T4DNAPolymerase的活性。

一般的Klenow Fragment和T4 DNA Polymerase都有5\"-3\"聚合酶活性和3\"-5\"外切酶活性，因此都可以用于补平和削平。所不同的是，T4DNA Polymerase的活性更强。

3. Klenow Fragment：

又称Klenow片段，是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNA

polymerase I)的大片断(Large Fragment)。Klenow Fragment保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。

特点：对5' 突出或3' 突出的粘末端都可以催化产生平末端，用于后续的平端连接。

用途：双链DNA 5' 端突出(5'overhang)末端的补平(fill-in)；双链DNA 3'端突出(3'overhang)的削平；5'突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。

来源：由大肠杆菌表达，表达基因的来源为polA 基因片段。

Fermentas公司的Klenow Fragment有2种。一种是DNA Polymerase I LargeFragment (Klenow Fragment)，该酶用于补平的时候不会在补平后再多加碱基。另一种是DNA Polymerase I Large Fragment, ExonucleaseMinus[Klenow Fragment exo-]，此酶没有3\"-5\"外切酶活性，因此不能用于削平；而且，此酶在补平的时候会在补平后再加一个或更多碱基，所以不太适合用于补平。

4. T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）:

T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK，该酶能够催化磷酸在g-位和双链/单链DNA或RNA的5’-羟基末端以及3’-单磷酸核苷间进行转移和交换：5’-OH +NTP<=>5’-P+NDP。该酶还具有3’磷酸酶活性，将3’-磷酸基团从寡核苷酸的3’磷酸末端、脱氧3’-单磷酸核苷和脱氧3’-二磷酸核苷上水解掉。

用途：引物或PCR产物的5’末端磷酸化以便进行连接反应。合成DNA接头(Linker) 的5’末端磷酸化以便进行连接反应。DNA及RNA 5’末端的标记，用作寡核苷酸探针。

5. DNA聚合酶1:

1.能催化单个脱氧核糖核苷酸连接到DNA链的3'端.2.能沿5'端到3'端方向外切DNA(切除引物)

3.能沿3'端到5'端方向外切DNA(纠错,或者说DNA损伤的恢复)

6. DNA聚合酶2:

1.发挥作用需要镁离子和铵根离子存在

2.同样能参与DNA聚合酶1参与的反应,但聚合活性低3.能沿3'端到5'端方向外切DNA7. DNA聚合酶3:

1.主要负责DNA链的延伸

2.能沿3'端到5'端方向外切DNA

在DNA的复制中,DNA聚合酶3负责合成冈崎片段,而DNA聚合酶1负责将RNA引物按逐个核糖核苷酸切除并替换成对应的脱氧核糖核苷酸,最后由DNA连接酶把各冈崎片段连接起来,复制完成.

活性(37度时每个酶分子每分钟聚合的核苷酸数)：DNA聚合酶1为600，DNA聚合酶2为30，DNA聚合酶3为9000。

8. DNA水解酶与DNA性内切酶的区别概述

DNA水解酶：催化DNA水解的一种酶，在DNA水解酶作用下，DNA被水解为一个一个的脱氧核苷酸。任何能水解DNA的酶的统称，见到二酯键就切。

性内切酶：能切割DNA分子内部的可识别序列的磷酸二酯键，见到识别序列的两侧的磷酸二酯键就切。9. DNA聚合酶和DNA连接酶的区别?

DNA连接酶：是一种将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶。常用于基因工程，将目的基因连在载体(一般为质粒)上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键。

DNA聚合酶：以已有的核酸序列作为模板，将4种脱氧核苷酸(A、T、G、C)按照模板的碱基排列顺序，以“碱基互补原则”依次连接，聚合成为一条新的DNA链。相同点都是连接的磷酸二酯键。

10. DNA水解酶在哪里有作用,作用是水解DNA双链吗?

DNA水解酶的作用位点在于磷酸二酯键；DNA在水解酶的作用下，可以得到四种不同的核苷酸，即腺嘌呤脱氧核苷酸

【A】，鸟嘌呤脱氧核苷酸【G】，胞嘧啶脱氧核苷酸【C】，胸腺嘧啶脱氧核苷酸【T】。

DNA在水解酶破坏了氢键和磷酸二酯键，DNA初步水解可以得到脱氧核苷酸。

DNA分子彻底水解的产物是磷酸 脱氧核糖和A C G U 四种碱基，这就就需要另外一种酶了。