苦马豆素研究进展

资料

苦马豆素研究进展

吴　达1,梁　冰2,冯志刚2,师彦平2

(1.西北农林科技大学畜牧兽医学院,陕西杨凌　712100;2.中国科学院兰州化物所西北天然药物研究中心)

　　　　　　中图分类号:S853.7　　　　文献标识码:B　　文章编号:100026354(2003)0220042204

1　苦马豆素研究简史

苦马豆素(swainsonine)因最初分离于灰苦马豆(Swain2

sonacanesces)而得名〔1〕

。其发现历经一个世纪。自从Marsh(1905～1907)〔2〕

证实疯草病与采食某些棘豆属和黄芪属植物有关以后,许多学者进行了毒素的分离研究。Cauch(1929)〔3〕从兰伯氏棘豆中分离出一种疯草毒素,可以引起猫的疯草病,他描述这种毒素是一种稳定的带有多羟基的含氮化合物,易溶于水,不溶于氯仿、乙醚和烃类溶剂,但由于当时条件所限未能进行结构鉴定。Frap(1936)〔4〕从密柔毛黄芪中分离出一种毒性成分,呈碱性,吸水性强,取名为洛克因(Locoin),洛克因及其衍生物醋酸盐、酒石酸盐和柠檬酸盐都可以引起疯草中毒症状,但由于与一般生物碱试剂反应不明显,未能确定为生物碱。苏联学者CePOb(1975)曾从短柔毛棘豆中用10%氨水提取总生物碱,并用TLC分离出三种生物碱,但也未作出结构鉴定。

由于灰苦马豆中毒与人类和动物的遗传性溶酶体贮积病——甘露糖过多症(mannosidosis)的病理学及生物化学方面的变化相似,而甘露糖过多症是由于缺乏Α-甘露糖苷酶(Α-mannosidase,AMA)引起的,澳大利亚学者Colegate(1979)〔1〕利用Α-甘露糖苷酶为工具从灰苦马豆中首次分离出一种纯毒素,并鉴定为吲哚兹定生物碱——苦马豆素(in2dolizidinealkaloids-swainonine)。这是一个突破性的进展。鉴于澳大利亚学者Maiden(1901)〔5〕发现澳大利亚绵羊灰苦马豆中毒的症状与美国绵羊疯草中毒非常相似,Hartley(1978)〔6〕将灰盔叶苦马豆(swainsoniagalgifolia)同斑荚黄芪、A.ebentissimu和绢毛棘豆进行了比较毒性试验,结果发现试验动物中毒后,不仅临床症状一致,而且病理组织学变化方面也没有明显差异,都表现出神经细胞和部分内脏细胞空泡化。美国学者Molyneux(1982)〔7〕以Colegate分离出的苦马豆素为标准品从斑荚黄芪和绢毛棘豆中分离出苦马素和氧化氮苦马豆素(SwainsonineN-oxide)。并认为苦马豆素是美国疯草的主要有毒成分。

在我国,曹光荣等(1989)〔8〕从黄花棘豆中分离出苦马豆素,并证实了这种生物碱对Α-甘露糖苷酶有很强的抑制作用。随后顾百群、王凯、赵宝玉、黄有德等人的实验进一步证实了黄花棘豆、茎直黄芪、变异黄芪中也含有苦马豆素。童德

文等(2000)〔9,10〕

通过升华法和高效液相色谱分离法从甘肃棘豆中分离得到苦马豆素纯品,提取率分别为010014%和010052%。Jamesetal(1989)在苦马豆素及相关糖苷酶抑制剂学术会议上指出,苦马豆素是植物能引起疯草中毒症状的唯一毒素。

2　苦马豆素理化特性

苦马豆素的分子式为C8H15NO3,分子量173,熔点144～145℃,纯品为白色针状晶体,酸解离常数pKa为714。苦马豆素属吲哚兹定生物碱,因其分子是在吲哚兹定环的1,2,8位上各带有一个-OH,故被命名为1,2,8-三羟基八氢吲哚兹定(1,2,8-trihydroxyoctahydroindolizidine),从有机物分类上看,因其三个羟基直接连在碳原子上,应该属于醇,故被命名为吲哚兹定三醇(indolizidinetriol)〔1〕。3　苦马豆素的来源

目前知道含苦马豆素的植物有豆科黄芪属和棘豆属(统称为疯草),分布于全世界,危害最严重的是美国和中国,其次是苦马豆属,如灰苦马豆,主要危害在澳大利亚。由于世界各国尚未对此类植物进行系统的分类研究,所以究竟有多少种植物含苦马豆素,现在还不清楚。根据现有的研究资料将一些含苦马豆素的植物列表如下(表1)。苦马豆素在干物质中相当稳定,可以保存数年〔11〕。

表1　已知的含苦马豆素植物及其含量

(引自童德文博士论文)

　　　植物名称苦马豆素含量󰃗%

文献来源　　　

斑荚氏(种子)

0.36Molynexetal(1989)(A.lentiginosus)斑荚黄芪变种(绿色)0.037Molynexetal(1989)(A.lentiginosusvar.dihysus)斑荚黄芪变种(黑色)0.032Molynexetal(1989)(A.lentiginosusvar.dihysus)

黄色黄芪变种

0.035

Molynexetal(1989)

(A.flavusvar.argillosus)

绢毛棘豆

叶0.007～0.009(O.sericea)

花0.008～0.103Molynexetal(1989)荚0.022～0.154黄花棘豆

0.012曹光荣等(1989)

(O.ochrocehala)

甘肃棘豆

0.021曹光荣等(1989)(O.kansronisis)

急弯棘豆

0.025曹光荣等(1989)(O.deflexa)变异黄芪(甘肃)0.029曹光荣等(1989)(O.variabilis)茎直黄芪(西藏)0.005

曹光荣等(1989)

(A.stictus)

灰苦马豆

全草0.0050Colegateetal(1984)

(S.canescens)

种子0.0033Dorlingetal(1989)植物0.0182

Dorlingetal(1989)

2003年第2期

Schneideretal(1983)从豆类丝核菌(Rhizoctonialegu2

minicola)中分离出苦马豆素〔12〕

。Tulsianietal(1984)用苦马豆素和疯草饲喂猪做比较,结果二者的生物化学和病理学变

化基本上是一致的〔13〕。杨鸣琦等(1996)也从自行分离的豆类丝核菌中提取、分离出苦马豆素,其自然干燥菌丝体中苦马豆素含量为1123%～2199%。

美国Yasuda(1984)〔14〕、Bennett(1989)先后人工合成了苦马豆素。随后加拿大Toronto化学研究所也有了合成产

品。我国童德文等(2000)人工合成苦马豆素成功。但是目前无论是生物合成、提取及人工合成产品都比较昂贵,每毫克价格为152美元。

4　苦马豆素的毒性研究

4.1　苦马豆素毒性国外研究

自从Colegate(1979)和Molyneux(1982)先后从灰苦马

豆和斑荚黄芪中分离出苦马豆素并确定为疯草的主要有毒成分后,许多学者就开始用苦马豆素对大鼠、绵羊、猪和牛进行毒性试验。Tulsiani等(1984)在猪的饮水中加入100mg󰃗(kg.d)苦马豆素,71d后出现典型的疯草中毒症状,组织学检查其靶器官发现,细胞胞浆空泡变性,肝细胞高尔基体甘露糖苷󰂫降低,而组织中低聚糖明显增加,其中以Man5Gic-Nac2和Man4Glc-Nac2含量增高。Novikoff等(1985)〔15〕通过大鼠毒性试验证明,苦马豆素能迅速引起肝、肾细胞的空泡变性,并在肾脏中检测出低聚糖。Warrant等(1983)〔16〕通过高效液相色谱法从苦马豆素中毒绵羊的尿液中分离到11种低聚糖。Abraham等(1983)〔17〕用高效液相色谱法分析中毒动物低聚糖代谢过程显示,苦马豆素有专一抑制溶酶体酸性Α-甘露糖苷酶和甘露糖苷酶󰂫的特性,中毒动物出现

与疯草中毒相似的症状。James等(1991)〔18〕

在海拔3000m地区将苦马豆素混入乳中喂给犊牛,结果复制出典型的疯草

中毒症状。James等认为,苦马豆素在体内也可代谢后转移到乳中,引起幼畜中毒。以上研究进一步证实了苦马豆素是疯草的主要有毒成分。Steglmeier(1995)〔19〕每天给绵羊苦马豆素110mg󰃗kg,2或3周,累计剂量1317或2116mg󰃗kg,未引起临床中毒症状,并分析了血液、肌肉、脑、甲状腺、肝脏、肾脏等组织器官中苦马豆素的含量。该试验未出现中毒症状,这与疯草中毒需数周或更长时间的其他试验结果一致,同时也证明了苦马豆素在体内引起中毒的蓄积性。4.2　苦马豆素中毒剂量国内研究

王凯等(1990)〔20〕、顾百群等(1990)〔21〕每天给山羊苦马豆素112mg󰃗kg(黄花棘豆10g󰃗kg)或甘肃棘豆211mg󰃗kg(甘肃棘豆10g󰃗kg),实验羊于18

～22d(累计食入苦马豆素2116～4612mg󰃗kg)出现中毒症状。赵宝玉(1992))〔22〕每天

给山羊苦马豆素112mg󰃗kg(茎直黄芪),实验羊于40～45d出现中毒症状。丁伯良(1994)〔23〕每天给公山羊苦马豆素211

mg󰃗kg(甘肃棘豆10g󰃗

kg),于第18天(累计苦马豆素3718mg󰃗kg)出现中毒症状。汤承(1989)〔　每天给怀孕母羊苦马24〕

豆素1144mg󰃗kg(黄花棘豆12g󰃗

kg),怀孕羊分别于15、21、22、33d(累计食入苦马豆素分别为2116、30124、31168、

47152mg󰃗kg)全部流产,丁伯良(1994)〔25〕

每天给怀孕母羊苦马豆素211mg󰃗kg(甘肃棘豆10g󰃗kg),于10～43d(累计食入苦马豆素2110～9013mg󰃗kg)全部流产。

43

4.3　苦马豆素的毒性作用机理

苦马豆素为水溶性,在动物肠道迅速被吸收,并且很快通过尿液、粪、奶排出。慢性中毒动物血浆苦马豆素清除率(半衰期)小于20h,从这样迅速的清除可以认为,停止摄食疯草后5～6d,中毒动物应当没有毒素残留。因此,中毒动物停止摄食疯草后,细胞修复很快开始。但是,细胞功能紊乱可能延长数天或数周,有些残留的损伤,例如神经损伤,可能导致永久性神经功能紊乱〔26〕。苦马豆素为含氮的类似糖一样的分子,它是几种甘露糖苷酶的抑制剂。

Α-甘露糖苷酶导致部分合成的低聚糖和糖蛋白在溶酶体内聚集。苦马豆素也抑制高尔基氏体甘露糖苷酶󰂫,此酶是许多蛋白包括激素、膜受体和受体酶糖基化作用的关键。

4.4　苦马豆素的临床前毒性研究

临床前毒性研究(Dennis等,1990;Noviloff等;1985,

Pritohard等,1987)表明,大鼠对苦马豆素有很好的耐受性。经微型等渗泵每天给青年大鼠苦马豆素46mg󰃗kg,3周未发现死亡。但苦马豆素能降低食欲,抑制青年大鼠的生长,引起组织包括中枢神经系统溶酶体低聚糖贮积。然而此实验未发现神经毒性。

5　苦马豆素抗肿瘤活性研究

5.1　苦马豆素对肿瘤扩散和转移的影响

天冬酰胺或N—低聚糖是最常见的糖蛋白类型之一,见于真核类细胞的膜或分泌糖蛋白。这些糖蛋白的低聚糖部分可能是富含甘露糖的“杂化”型或“复合”型结构。许多证据表明,瘤细胞表面低聚糖在恶性肿瘤的表达上起着重要的作用。这种情况主要是天冬酰胺-复合型糖蛋白广泛分支间或糖蛋白或糖脂质上低聚糖终端唾酸化增加的结果〔27〕。

为了证实“高度唾酸化、复合型”低聚糖是肿瘤转移的关键这一假设,Olden等(1989)应用依霉素(tunicamycin)、苦马豆素(swainsonine)、脱氧野艽霉素(deoxynojirrimycin)、脱氧甘露野艽霉素(deoxymannojirimycin)和栗精胺(cas2

tanospermine)抑制糖基化作用或天冬酰胺-低聚糖的合成。Inmura等首次描述了将B16鼠黑色素瘤细胞静脉注射给无

胸腺小鼠后,依霉素对其转移潜力的影响。注射前,瘤细胞单层培养,用依霉素处理24～48h,除去细胞的N-低聚糖。这个处理使受试鼠肺瘤的形成几乎完全受到抑制。随后Olden等也有相似的报道。目前,低聚糖合成抑制剂,如苦马豆素、栗精胺、脱氧野艽霉素已经在实验性肿瘤转移模型上试验对肿瘤转移的影响。

为了检验N-低聚糖结构和肿瘤转移之间的关系,B16-F10黑色素瘤细胞在苦马豆素(3mg󰃗l)中亚融合培养24h后,静脉注射给同源小鼠,24h后肺转移受到抑制,并有明显的剂量依赖性,多次实验的抑制率均大于80%。天然与合成的苦马豆素结果相似。估计在亚融合培养期间,瘤细胞蛋白发生了重要翻转并伴随杂化型低聚糖取代了复合型低聚糖。

从苦马豆素破坏瘤细胞转移增殖能力的事实来看,膜糖蛋白类部分的特殊结构特征是瘤细胞成功地转移增殖于靶器官的关键。用MDAY-D2鼠淋巴网状瘤细胞也获得了相似结果,在这种条件下,经苦马豆素处理后,所有的复合型低聚糖转变为杂化型结构。

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最近,报道了用M5076和B16—BL16鼠瘤细胞系来研究一种自发瘤转移型的临床相关性。前者是高度入侵性网状肉瘤,由手术背部植入,可转移到内脏器官,包括肝和脾。后者是一种黑色素瘤,能自发地从趾垫肌肉注射转移并在肺上增殖。Newton等证明,苦马豆素通过饮水有效地抑制B16—

BL16自发转移,抑制率达88%,M5076网状肉瘤的肺和肝的

转移抑制率达95%。在试验中,苦马豆素的抗肿瘤转移活性在水中的有效浓度为3mg󰃗l。

这些发现表明苦马豆素的抗肿瘤转移活性不限于人工或实验性诱发的肿瘤转移,也不限于一种瘤型或者特定器官。

5.2　苦马豆素对荷瘤动物生存时间的影响

用苦马豆素结合免疫调节剂聚肌胞(polyIC)或白细胞介素-2(IL—2)进行试验。当苦马豆素单独持续使用时,在注射B16—BL16黑色素瘤细胞的动物和未治疗动物之间没有明显差异。但当苦马豆素结合polyIC或IL-2使用时,其生存时间明显不同。例如,在注射瘤细胞后65d时,未治疗动物或单独使用苦马豆素的动物100%死亡,polyIC治疗动物

75%死亡,polyIC和苦马豆素结合治疗动物15%死亡,单独

使用IL-2者20%死亡,IL-2和苦马豆素同时治疗的动物没有死亡。

对荷瘤小鼠缺乏效果,是由于许多因素造成,如干扰T细胞。例如,用高剂量环磷酰胺处理有皮下荷瘤的小鼠,以消灭这种细胞群,然后用苦马豆素进行治疗,则大大增加了小鼠的存活时间。

5.3　苦马豆素对人肿瘤在无胸腺小鼠上生长的影响

Dennis等(1989)首次报道了苦马豆素能抑制人类肿瘤的生长,该研究表明苦马豆素单用或结合Α-干扰素能抑制体内生长的HT29结肠癌;对组织培养中的人类瘤细胞,如SM12直肠癌和A375黑色素瘤也有抗增殖活性。最近,他们证明苦马豆素抑制无胸腺裸鼠皮下异源性皮移植的生长和人乳腺癌在肺部的转移可达到50%～80%。经静脉注射瘤细胞的实验性诱发导致的肺转移,在动物保持饮苦马豆素水时则转移明显降低。例如,对照组71%的小鼠转移不小于50%,而在饮苦马豆素水的动物中有相似肺病变的在25%以下。事实上,治疗组大约有12%的动物未检查出瘤转移。相比之下,苦马豆素对人工培养生长的各种瘤细胞系的增殖没有影响,从而表明在体内的这种生长抑制不是药物对瘤细胞的直接影响。

5.4　苦马豆素的抗肿瘤作用机理

Humphries等(1986)、Dennis(1986)的研究结果表明,两种不同的苦马豆素处理方法可用于抑制肿瘤的转移或恶性肿瘤的扩散。最初在体外处理瘤细胞,然后静脉注射给动物,由于高尔基体的Α-甘露糖苷酶󰂫受到抑制,引起细胞表面低聚糖结构发生变化,从而改变了特殊膜糖蛋白的表达。但给宿主机体应用苦马豆素可能是通过免疫调节机理间接发挥作用的。

两种方法经不同机理抑制肿瘤转移。首先,苦马豆素可使机体内源性免疫抑制因子诱发的鼠淋巴细胞增殖减少恢复;第二,苦马豆素抑制肿瘤转移的情形与NK细胞激活的动力学变化一致;第三,停止使用苦马豆素后抗肿瘤转移的时间(5～7d)也与宿主增强细胞免疫效应机理一致。

中兽医医药杂志　JTCVM

苦马豆素能促进诱发促细胞有丝分裂剂IL—2的产生及人外周血液淋巴细胞受体的表达。苦马豆素能使人淋巴细胞从Go过渡到G1的比例增加,并在引入半刀豆蛋白后进入细胞周期。Grze-gorzewski等(1990)已经证明,苦马豆素能激活腹腔吞噬细胞结合活性以对抗瘤细胞。该研究发现,使用苦马豆素后吞噬细胞活性比常用体内激合剂小棒状杆菌所获得的结果高3倍。在引入巯基乙酸盐的腹腔吞噬细胞体外培养中加入苦马豆素的活激水平比已知吞噬细胞激活剂(如脂多糖或重组Χ-干扰素)高6～8倍。这些研究不仅对治疗肿瘤、感染性疾病、免疫抑制性疾病有重要意义,而且可阐明吞噬细胞激活的机理。

随着苦马豆素研究的不断深入,我们相信苦马豆素不久将会应用于医学和兽医学临床,使许多疑难病症得到有效的控制和治疗。

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临・床・集・锦

中兽医辨证治愈骡肺出血

　　肺出血,中兽医称“咳血”,多为肺胃阴亏、实火上炎之证。马属动物肺出血临床报道较少。笔者曾遇1例,单用西药治疗,效果不理想,结合中兽医辨证施治,很快痊愈,现报道如下。

2001年3月5日,同仁县加吾乡沙果日村旦巴的一匹10岁黑母骡因病就诊。主诉:该骡今晨驮运木料后即见两鼻孔和口腔流含泡沫样鲜红血液,饮水较往常多,食欲正常。初诊检查:病骡营养中等,呼吸促迫,咳嗽,体表有汗。口干舌燥,舌色红,粪尿较少。肺部听诊有湿性口罗音,呼吸64次󰃗min,体温3918℃,心音亢进,心跳疾速,80次󰃗min。口鼻徐徐流含有大量泡沫的鲜红色血液,且不易凝固。遂用西药10%氯化钙、10%水杨酸纳、40%乌洛托品50ml及VK3、30%安乃近、青、链霉素、安络血等多次进行治疗。3月6日下午4时30分,鼻孔和口腔流血基本同前,唯咳稍有缓解。呼吸48次󰃗min,心跳69次󰃗min,体温3818℃。病情虽有所好转,但不显著。

该病骡由于劳役过度,肺胃热盛,春季肝木火旺,致阴虚

火旺,肺胃之热上壅熏蒸,热极化火,灼伤肺络,迫血妄行,故血溢肺窍;肺金火盛,故气促喘粗,舌燥红,体热有汗,劳役太过,饮水不足,燥热熏蒸,肺肾阴虚,气津两伤,故咳嗽、多饮。此为肺胃阴亏,实火上炎之证。治宜育阴降火,润肺化痰,敛肺止血。方用百合固金汤加栀子、白芨、地榆。药用百合32g,生地30g,熟地24g,玄参21g,麦冬24g,当归24g,白芍30g,桔梗20g,贝母18g,栀子20g,白芨32g,地榆炭18g,甘草18g。研细末,水煎,1次灌服。辅以氯化钙、水杨酸钠、乌洛托品及青、链霉素,以抗菌消炎。1剂后,鼻血骤减。第2天再服1剂,至第3天流血停止,呼吸平稳,心跳60次󰃗min,趋于正常,体温3817℃。为巩固疗效,继服1剂。追访,无复发。

方中百合、麦冬润肺生津;生地、玄参滋阴清热;当归、熟地、白芍养血和阴;桔梗、贝母清肺化痰;地榆、白芨敛肺止血;栀子清热泻火凉血;甘草解毒,润肺止咳,调和诸药。诸药配伍使阴液充足,火热自除,痰化热退,咳血自止,药到病除。

(青海省同仁县畜牧兽医站　811300　曹　谦)

更正:　2003年《中兽医医药杂志》第1期第38页左栏第4～5行“20ml”应为“2ml”。特此更正。