原核生物DNA的复制

原核生物DNA的复制

1．与复制有关的酶及蛋白质： （1）拓扑异构酶：通过切断并连接DNA双链中的一股或双股，改变DNA分子拓扑构象，避免DNA分子打结、缠绕、连环，在复制的全程中都起作用。其种类有：拓扑异构酶I和拓扑异构酶II，拓扑异构酶I能切断DNA双链中一股并再连接断端，反应不需ATP供能；拓扑异构酶II能使DNA双链同时发生断裂和再连接，需ATP供能，并使DNA分子进入负超螺旋。 （2） 解螺旋酶： DNA进行复制时，需亲代DNA的双链分别作模板来指导子代DNA分子的合成，解螺旋酶可以将DNA双链解开成为单链。大肠杆菌中发现的解螺旋酶为DnaB。 （3） 单链结合蛋白（SSB）：在复制中模板需处于单链状态，SSB可以模板的单链状态并保护模板不受核酸酶的降解。随着DNA双链的不断解开，SSB能不断的与之结合、解离。 （4） 引物酶： 是一种RNA聚合酶，在复制的起始点处以DNA为模板，催化合成一小段互补的RNA。DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP聚合反应，若没有引物就不能起始DNA合成。引物酶能直接在单链DNA模板上催化游离的NTP合成一小段RNA，并由这一小段RNA引物提供3’-OH， 经DNA聚合酶催化链的延伸。 （5） DNA聚合酶：是依赖DNA的DNA聚合酶，简称为DNA pol，以DNA为模板，dNTP为原料，催化脱氧核苷酸加到引物或DNA链的3’-OH末端，合成互补的DNA新链，即5’→3’聚合活性。原核生物的DNA聚合酶有DNA polI、DNA pol II和DNA pol III，DNA pol III是复制延长中真正起催化作用的，除具有5’→3’聚合活性，还有3’→ 5’ 核酸外切酶活性和碱基选择功能，能够识别错配的碱基并切除，起即时校读的作用；DNA pol I具有5’→3’聚合活性、3’→ 5’和5’→3’核酸外切酶活性，5’→3’核酸外切酶活性可用于切除引物以及突变片段，起切除、修复作用。另外，klenow片断是DNA pol I体外经蛋白酶水解后产生的大片段，具有DNA 聚合酶和3’→ 5’外切酶活性，是分子生物学的常用工具酶。DNA pol II 在无DNA pol I和DNA pol III时起作用，也具有5’→3’和3’→ 5’ 核酸外切酶活性。 （6） DNA连接酶：DNA连接酶用于连接双链中的单链缺

口，使相邻两个DNA片段的3’-OH末端和5’-P末端形成3’,5’磷酸二酯键。DNA连接酶在DNA复制、修复、重组、剪接中用于缝合缺口，是基因工程的重要工具酶。

2．DNA的合成过程：可将复制过程分为起始、延长和终止三个阶段。 复制起始：（1） 辨认起始点，合成引发体：在E.coli，复制起始点称为oriC，具有特定结构能够被DnaA蛋白辨认结合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白使DnaB蛋白结合于起始点，DNA双链局部被打开，引物酶及其他蛋白加入，形成引发体。 （2） 形成单链：DNA进行复制时，首先在拓扑异构酶作用下，使分子的超螺旋构象变化，然后在解链酶的作用下，解开双链，才能开始进行DNA的合成。解螺旋酶在蛋白因子的辅助下打开DNA双链，单链结合蛋白SSB结合于处于单链状态模板链上；拓扑异构酶使DNA分子避免打结、缠绕等，在复制全过程中起作用。 （3） 合成引物：引发体中的引物酶催化合成RNA引物，由引物提供3’-OH基，使复制开始进行。领头连和随从链均由引物酶合成引物，随从链在复制中需多次合成引物。 复制延长： （1） 复制方向：原核生物如E.coli，只有一个起始点oriC，两个复制叉同时向两个方向进行复制，称为双向复制。 （2） 链的延长：按照与模板链碱基配对的原则，在DNA聚合酶III的作用下，逐个加入脱氧核糖核酸，使链延长。由于DNA双链走向相反，DNA聚合酶只能催化核苷酸从5’→3’方向合成，领头链的复制方向与解链方向一致，可以连续复制，而另一股模板链沿5’→3’方向解开，随从链的复制方向与解链方向相反，复制只能在模板链解开一定长度后进行，因此随从链的合成是不连续的，形成的是若干个岡崎片段。DNA聚合酶I的即时校读，DNA聚合酶III的碱基选择功能，使复制具有保真性。 复制终止： 原核生物如E.coli，他的两个复制叉的汇合点就是复制的终点。由RNA酶切去领头链和随从链中的引物，引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化，四种脱氧核糖三磷酸为原料自5’→3’方向延长填补。最后，DNA连接酶由ATP供能，将两个不连续片段相邻的5’-P和3’-OH连接起来，成为连续的子链，复制完成。

原核生物与真核生物DNA复制过程的不同点： 1. 真核生物中DNA进行的速度约为50核苷酸/秒，仅为原核生物的1/10。但真核生物染色体上DNA复制起始点有多个，因此可以从几个起始点同时进行复制。如人染色体上平均有100个起始点，其上有200个复制叉进行复制。真核生物复制起始点在发育过程中可以发生变化，如果蝇在胚胎发生早期，其最大染色体上有6000个复制叉。因此，真核生物复制起始点还受细胞周期时相的控制。 2. 真核生物DNA复制只发生在细胞周期的特定时期，即合成期（S期）。而且真核生物染色体在全部复制完成之前，各个复制点不能开始新的复制，也就是说，每个细胞周期内复制起始点只能发动一次，即 核内DNA合成只能进行一次。而原核生物DNA复制起始点却不受这种调控，在一个细胞周期内可以连续开始新的复制事件。 3. 真核生物参与DNA复制的DNA聚合酶及蛋白质因子与原核生物有区别。前者的DNA聚合酶中，DNA polα及DNA polδ在细胞核内DNA复制中起主要作用， DNA polδ催化前导链及随从链的合成，增殖细胞核抗原（PCNA）参与其作用，DNA polα与引物酶共同引发链的合成。DNA polδ有3＇→5＇外切酶活性，故有校正功能。DNA polγ是线粒体中的复制酶。 4. 真核生物DNA复制过程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。动物细胞中的引物约为10个核苷酸，而原核生物中则可高达数十个。真核生物中冈崎片段约有100~200个核苷酸，而原核生物中则可高达1000~2000个核苷酸。 相同点：均为半保留复制；半不连续复制；都有起始、延伸、终止三阶段；具高保真性。