新生鼠体外神经干细胞培养_分化及鉴定

·基础科研论著·

新生鼠体外神经干细胞培养、分化及鉴定２２

，王钰１，尹晓娟１，

北京　１安徽合肥　２１北京军区总医院附属八一儿童医院，００７００；２安徽医科大学研究生学院，３０００１

无Ｄ大鼠神经干细胞体外分离培养基鉴定的方法。方法　分离新生ＳＤ大鼠海马组织，　目的　探索新生Ｓ　　摘　要：

血清培养技术培养神经干细胞，免疫组织化学技术检测其巢蛋白的表达；并用溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验，免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况；诱导神经干细胞分化，分别用神经元特异性烯醇化酶抗体和胶质纤维酸性蛋白抗体进行免疫组织化学技术鉴定分化细胞。结果　获得大量悬浮生长的单克隆神经球，并可以分化为神经元和星形胶质细胞。自我更新和多分化潜能，为体外基础和临床研究奠定基础。结论　成功培养的新生ＳＤ大鼠神经干细胞具有增殖、

关键词：　新生鼠；神经干细胞；细胞培养；免疫细胞化学

（）６００４２６　　文献标识码：００８５７９２０１４０１０３１４ＱＡ　　文章编号：１－－－　　中图分类号：

１２

，，ｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏｏｆｔｈｅｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｎｅｏｎａｔａｌｒａｔ．ｕＩＮ　ｉａｏＣＷＡＮＧ　ＹＹＸ　　　　　　　　　　　　－１２

（ｕａｎａｉｈｉｌｄｒｅｎｏｓｉｔａｌｉｌｉａｔｅｄｏｅｎｅｒａｌｏｓｉｔａｌｅｉｉｎｉｌｉｔａｒｏｍｍａｎｄｅｏｌｅｉｂｅｒａｔｉｏｎ．１ＢＣ＇ｓ　ＨＡｔＧＨｏＢＭＣｏＰ＇ｓＬ　　　　　　　　　ｊｙｐｆｐｊｇ　ｙｐｆｆ　ｆ　　

，２ＢＣ２ＧＳｏＡＭＵＨＡＣＡｒｍｅｉｉｎ００７００，ｈｉｎａ；ｒａｄｕａｔｅｃｈｏｏｌｎｈｕｉ　ｅｄｉｃａｌｎｉｖｅｒｓｉｔｅｅｉｎｈｕｉ３０００１，ｈｉｎａ）　　　　　ｆ　ｙ，ｊｇ１ｙ，ｆ，

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：，Ａｂｓｔｒａｃｔｂｅｃｔｉｖｅｏｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ　Ｏ　Ｔ　　　　　　　　　　　ｇｊ（）ＮＳＣｓｆｒｏｍｎｅｏｎａｔａｌｒａｔｓ．ｅｔｈｏｄｓｉｏｃａｍｕｓｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｎｅｏｎａｔａｌＳＤｒａｔｓａｎｄＮＳＣｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｓｅｒｕｍ　　　Ｍ　Ｈ　　　　　　　　　　　　ｐｐｐｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ＴｈｅｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＮＳＣｓｗａｓｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ．ＮｅｓｔｉｎｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎＮＳＣｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂ　　　　　　　　　　　　ｐｐｙ　ａｎｄｄｏｕｂｌｅｒｏｍｏｄｅｏｘｕｒｉｄｉｎｅ（５ｒｄＵ）ｉｎｃｏｒｏｒａｔｉｏｎａｓｓａａｒｋｅｄｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｂｂｏｔｈｏｆ５ａｓｓｅｓｓｅｄｂ　　　　－－Ｂ－ｍ－　　　ｙｐｙｙ　　，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄＮＳＣｓａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｏｆｎｅｕｒｏｎｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＮＳＣｓｗａｓｉｎｄｕｃｅｄ．Ｔｏｉｄｅｎｔｉｆｃｉｆｉｃｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ）ａｎｄａｎｔｉｂｏｄｅｓｅ　　　　　　　　　　　－－ｙｐ　

ｏｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎ．ｆｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒａｃｉｄｉｃｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＡＰ）ｗｅｒｅｅｍｌｏｅｄｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ　　　　　　　　　ｙｇｐｐｙｐｙｇｙ　　　Ｒｅｓｕｌｔｓｍａｓｓｏｆｎｅｕｒｏｓｈｅｒｅｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＴｈｏｓｅＮＳＣｓｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｎｅｕｒｏｎｓａｎｄａｓｔｒｏｃｔｅｓ．ｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ａ　　　　　　　　　　　　　Ｃｐｙ，，ｒｈｅｆｅｔａｌｒａｔＮＳＣｓａｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｏｂｔａｉｎｅｄｗｈｉｃｈｈａｖｅｔｈｅｃａａｃｉｔｉｅｓｏｆｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｅｌｆｅｎｅｗａｎｄｌｕｒｉｏｔｅｎｔｉａｌｉｔ．－　　　　　　Ｔ　　　　　　　ｐｐｙｐｐｙ　

，ｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｂａｓｉｃａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｎｅｕｒｏｎｓａｎｄａｓｔｒｏｃｔｅｓｌａ　　　　　　　　　　　　　　ｙｙｙ　　

：；；；Ｋｅｗｏｒｄｓｅｏｎａｔａｌｒａｔｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　ｎ　　　　ｙｙ　

ｈ　　由围生期缺氧所致的缺氧缺血性脑损伤（－ｙ

，是世界新生儿ｏｉｘｉｃｓｃｈｅｍｉｃｂｒａｉｎｄａｍａｅＨＩＢＤ）－　　ｐｇ死亡和婴幼儿致残的的主要原因，在全球足月儿和早产儿中，由ＨＩＢＤ引起的新生儿死亡率达

［］

新生儿期缺氧缺血是导致患儿脑损伤的重３％１，２

２］

。到要原因，可以引起运动障碍，认知缺陷和惊厥［］４３－，目前为止除了亚低温和促红细胞生成素之外［还

ＮＳＣｓ是一类能够长期自我更新的多能干细

胞，并在一定条件下具有分化的多潜能特性，可以形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。ＮＳＣｓ的分布具有较大的普遍性，到目前为止，已经从鼠类和人脑的海马、皮层、嗅球、纹状体以及第三、四脑

［］室、中脑、间脑等部位中分离培养出ＮＳＣｓ６－９。本实

，诱导分化及免疫细胞化学鉴验通过体外培养ＮＳＣｓ定等技术，为进一步了解和探索ＮＳＣｓ的生物学特性和相关作用机制提供了良好的实验平台。１　材料和方法１　材料１．

体重１．１．１　实验动物　新生１ｄ清洁级ＳＤ大鼠，

，（军）动物许可证号Ｓ由约８～１２００ｇＣＸＫ００７０４－（－－。北京军事科学院提供）

）单克隆抗体１．２　试剂　兔抗大鼠巢蛋白（ｅｓｔｉｎ１．ｎ）），，（小鼠抗大鼠ＢａｎｔａｒｄＵ单克隆抗体（ｈｅｍｉｃｏｎｓｃ，小鼠抗大鼠Ｎ细胞基础培ＳＥ单克隆抗体（ｂｃａｍ）ａ／新生小牛养基ＤＭＥＭＦ１２、Ｂ２７、Ｎ２、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、

没有随机对照临床试验证实某种治疗方法对新生儿具有促进神经发生的作用。因此，如何对ＨＩＢＤ进

行早期有效干预治疗以控制病情发展及防止其后遗症的发生，成为目前国内外研究的热点。目前的研，）移植究表明，神经干细胞（ｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＮＳＣｓｎ　　和诱导自身的ＮＳＣｓ分化有希望成为治疗ＨＩＢＤ新

５］

。手段［

【，作者简介】王钰（女，硕士学位，研究方向为新生儿脑损伤的９８６１－）临床与基础研究。

：【通信作者】尹晓娟，ａｉｌｉｎｘｉａｏｕａｎ６３．ｃｏｍＥ－ｍ＠１ｙｙｊ

３２中国儿童保健杂志２０１４年０１月第２２卷第１期　ＣＪＣＨＣＪＡＮ．２０１４，Ｖｏｌ２２，Ｎｏ．１　　

，血清（小鼠抗大鼠ＧｉｂｃｏＢＲＬ）ＦＡＰ单克隆抗体，ＧＩＴＣ标记的羊抗小鼠ＩＲＩＴＣ标记的羊Ｇ二抗，ＦＴｇ抗兔ＩＰ通用抗体试剂盒，ＡＢ试剂盒均Ｇ二抗，ＳＤｇ由北京中杉金桥生物公司提供，５－溴脱氧尿甘嘧啶（，）（，Ｂ２ｄ８试５ｒｏｍｏ＇ｅｏｘｕｒｉｄｉｎｅＢｒｄＵ）ｉｍａｃｋｓｃ－－－－ｙｇ

剂由碧云天公司提供其它试剂为国产分析纯。２　方法１．

２．１　ＳＤ乳鼠海马组织分离　脱颈处死２４ｈ内１．新生Ｓ超净台上Ｄ大鼠，５％乙醇浸泡消毒５ｍｉｎ，７参照取脑，迅速放入冰浴的盛有Ｄｈａｎｋ＇ｓ的平皿中，－老鼠解剖图谱剔除脑膜和血管，取出海马组织，用加入ｈａｎｋ＇ｓ液清洗三遍后将组织尽可能剪碎，Ｄ－吹打后加入胎牛血２５％的胰蛋白酶消化１５ｍｉｎ，０．

／清终止消化，用２００目筛网过滤，００ｒｍｉｎ离心８１０　，弃上清，管底的白色沉淀即单细胞悬液。用台ｉｎｍ

盼蓝拒染法进行活细胞计数。

２．２　ＮＳＣｓ培养　将所获得的单细胞沉淀用血１．

清培养基重悬，培养２４ｈ后去除表面漂浮的死细、、胞，并换为含有Ｂ２７（１∶５０）２（１∶１００）ＧＦ２０ＮＥ／／ｎｍＬ、ｂＦＧＦ２０ｎｍＬ、１％牛血清白蛋白的ｇｇ

５／／（无血清培养基培养，按５×１ＤＭＥＭＦ１２１∶１）０每瓶４ｍｍＬ的密度接种于２５ｍＬ培养瓶中，Ｌ，

每２～３ｄ根据细胞生长情况３７℃，５％ＣＯ２中培养，半量换液，５ｍｍ培养皿中５～７ｄ部分细胞接种于３，用于免疫细培养（内含多聚赖氨酸包被的盖玻片）胞化学检测，部分进行传代。

２．３　诱导细胞分化　将传代培养的神经球收集１．

离心，更换为１接种到３０％血清培养基，５ｍｍ培养，皿中（内含多聚赖氨酸包被的盖玻片）７℃、５％３收集长有细胞的盖ＣＯ～３ｄ后，２条件下静置培养１

玻片行免疫细胞化学检测。

２．４　免疫细胞化学鉴定ＮＳＣｓ及诱导分化的细１．

；胞　取出长有细胞的盖玻片，ＢＳ漂洗２×２ｍｉｎＰ，４％多聚甲醛处理１０ｍｉｎＰＢＳ漂洗３×２ｍｉｎ；

１０．５％ＴｘｉｔｏｎＸ００处理２０ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗３×２－　；；血ｍｉｎ３％Ｈ２Ｏ５ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗３×２ｍｉｎ２处理１

清封闭２加一抗（０ｍｉｎ；ＦＡＰ１：５０；ＮＳＥ１∶１００，Ｇ　　，阴性对照用Ｐ放入湿盒Ｎｅｓｔｉｎ１∶１００）ＢＳ代替，　７°Ｃ孵育１～２ｈ或者４°Ｃ过夜，ＢＳ漂洗３×２３Ｐ；二抗孵育２阴性对照用正常羊血清代ｍｉｎ０ｍｉｎ，

；辣根酶标记链酶卵白素工作替，ＢＳ漂洗３×２ｍｉｎＰ，；液孵育２封０ｍｉｎＰＢＳ漂洗３×４ｍｉｎＤＡＢ显色，片，镜下观察并摄片。

２．５　免疫荧光Ｎｅｓｔｉｎ＋ＢｒｄＵ双标鉴定ＮＳＣｓ增１．

，／殖　取出Ｎ加入Ｂ共同培养２ＳＣｓｒｄＵ（５ｍｍＬ）４ｇ

放入培养皿或培养板中（内含多聚赖氨酸包８ｈ，～４

被的盖玻片）孵育２～４ｈ。取出已经接种好细胞的盖玻片，ＢＳ漂洗２×５ｍｉｎ；４％甲醛处理１０ｍｉｎ，Ｐ；１ＰＢＳ漂洗２×５ｍｉｎ０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ００处理４５－　

；ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗２×５ｍｉｎ２ＮＨＣＬ变性３０～４５ｍｉｎ，；，封闭２ＰＢＳ漂洗３×５ｍｉｎ０ｍｉｎＰＢＳ漂洗２×５

，加一抗（ｅｓｔｉｎ１∶１００，ＢｒｄＵ１∶１００）ｍｉｎ；４℃冰箱Ｎ。加过夜或者３７℃孵箱１～２ｈ，ＰＢＳ漂洗５×５ｍｉｎ２抗（ＦＩＴＣ标记的羊抗小鼠ＩＲＩＴＣ标记Ｇ二抗、Ｔｇ

的羊抗兔Ｉ稀释液，均按１∶２阴性００稀释，Ｇ二抗）ｇ对照用正常羊血清代替二抗，７℃孵育１～２ｈ；ＰＢＳ３漂洗５×５ｍ封片，激光共聚焦摄片。ｉｎ；２　结　果

１　ＮＳＣｓ原代和传代培养　倒置相差显微镜下２．

大部分细胞为单个观察发现：ＳＣｓ在最初接种时，Ｎ圆形的细胞，悬浮生长，折光性较强。２～３ｄ可见２这些细胞成圆形，亮球～５个细胞组成的细胞团，

状。４～５ｄ可见神经球数量急剧增多，聚集成簇，此时神经球直径可增加到几百微米，由数百个细胞构成。传代细胞形态与原代细胞相似，传代培养１ｄ后细胞呈现早期分裂增殖的现象，随后聚集成簇，生长速度加快，经３～５ｄ即可见数十个细胞聚集成球，产生大量的克隆细胞球，可再次传代处７ｄ的培养，

理。传代后的细胞形态较原代细胞规则，生长稳定，形成神经球的比率大于原代细胞，但随着传代次数的增加，细胞的生长速度逐渐减慢，形成神经球的比率也逐渐降低。见图１。

）Ａ鼠原代初始培养细胞（×１００　　注：

）００×２　　Ｂ鼠原代细胞第３ｄ生长的神经球（）００×４　　Ｃ鼠原代细胞第５ｄ生长的神经球（）００×４　　Ｄ鼠传代细胞第７ｄ生长的神经球（

ＳＣｓ原代和传代培养　　图１　Ｎ

ｉ．１　Ｐｒｉｍａｒａｎｄａｓｓａｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｆｒｏｍ　ＮＳＣｓｏｆｒａｔ　　Ｆ　　　　　ｙｐｇｐｇ　２　ＮＳＣｓ诱导分化　悬浮生长的ＮＳＣｓ在更换为２．

中国儿童保健杂志２０１４年０１月第２２卷第１期　ＣＪＣＨＣＪＡＮ．２０１４，Ｖｏｌ２２，Ｎｏ．１　　３３

１０％血清培养基后不久即可见大部分细胞开始贴壁生长，细胞团边缘伸出大量突起，随着细胞的生长，突起向外呈放射状延伸，并交错成网状，分化的细胞呈。梭形、锥形、星形、多角形、并伸出长的轴突。见图２

１０］

已经证实，先用血无血清培养基培养。历俊华等［

清培养基预培养可以加快Ｎ提前ＳＣｓ的聚球速度，

收获ＮＳＣｓ球。至于血清预培养加速ＮＳＣｓ聚球原因目前尚不清楚，主要考虑与血清中的某些成分可加速Ｎ但具体机制还需要ＳＣｓ的表面粘附性有关，进一步研究。

对培养条件的ＳＣｓ是一类比较特殊的细胞，Ｎ

要求比较严格，本实验体外培养原代ＮＳＣｓ的培养／／、基成分为：Ｆ１２、ｂＦＧＦ（２０ｎＧＦ（２０ｍＬ）ＥＤＭＥＭｇ（／、、、白蛋白及青链２１∶１００）２７（１∶５０）ｎｍＬ）ＮＢｇ霉素，其中ＮＳＣｓ在细胞因子Ｎ２、Ｂ２７、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ添加剂的作用下可以持续分裂增殖，具有很强的自我更新能力。ｂＦＧＦ和ＥＧＦ是促进ＮＳＣｓ增殖的最常用的生长因子，它们具有丝裂原的作用，能够促进分裂并可以缩短群体倍增的时间。ＳＣｓ的生长、Ｎ

有研究表明，单一使用即可明显地促进大鼠ＮＳＣｓ的增殖分裂，联合使用ＥＧＦ和ｂＦＧＦ对促进ＮＳＣｓ的增殖具有较强的协同作用，比单独应用有明显的

１１］

。培养Ｎ差异［ＳＣｓ时加入ｂＦＧＦ和ＥＧＦ或是灭

）Ａ鼠ＮＳＣｓ诱导的分化细胞（×２００　　注：

）ＳＣｓ诱导的分化细胞（×４００　　Ｂ鼠Ｎ

ＳＣｓ诱导分化　　图２　Ｎ

ｉ．２　Ｉｎｄｕｃｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｒｏｍ　ＮＳＣｓｏｆｒａｔ　　　　　Ｆｇｇ　

２．３　ＮＳＣｓ增殖及诱导分化鉴定　Ｎｅｓｔｉｎ蛋白在

ＳＣｓ胞浆中表达，ＳＥ蛋白在神经元细胞胞浆中ＮＮ表达，ＦＡＰ蛋白在星形胶质细胞胞浆中表达，ＡＢＧＤ染色时阳性表达细胞胞浆被染成棕黄色；ｒｄＵ在增Ｂ免疫荧光染色时Ｂ殖状态ＮＳＣｓ细胞核中表达，ｒｄＵ阳性表达细胞细胞核成绿色，表明细胞处于增殖状态；若细胞胞ｅｓｔｉｎ＋ＢｒｄＵ免疫荧光双标染色后，Ｎ浆染成红色、细胞核染成绿色则表明ＮＳＣｓ处于增殖状态。阴性对照组均未被染色。见图３。

活的血清可以使巢蛋白表达阳性的细胞从４４．１％

［２］

。Ｅ上升到６２．５％１ＧＦ和ｂＦＧＦ不仅具有促进细

胞增殖的作用，对细胞分裂也有一定的效果，但只要调整适合的浓度，ＦＧＦ和ＥＧＦ就可抑制细胞分化，ｂ转向促进细胞增殖的作用。Ｂ２７是一种神经营养添加剂，主要含有必需脂肪酸、抗氧化剂和维生素等成分，是无血清培养基的理想添加剂之一。该培养基中不含血清成分，对分化的细胞起到抑制作用，使非从而提高培养细胞的纯度。ＳＣｓ最终走向死亡，Ｎ

分离２　ＮＳＣｓ分离方法的选择　ＮＳＣｓ培养中，３．

１３］，但单细胞的方法有酶消化法和机械分离法两种［

这两种方法却各有利弊，消化细胞所用的胰蛋白酶虽然可以有效地断开细胞间的连接，但却破坏了细胞表面的受体，损伤了细胞的增殖和分化潜能；此外消化效果也会受消化酶的消化时间、浓度和温度等

）Ａ鼠传代ＮＳＣｓ培养７ｄ阳性表达细胞（ＡＢ，×４００Ｄ　　注：

）ＳＣｓ分化３ｄ后ＧＦＡＰ阳性表达细胞（ＡＢ，×４００Ｄ　　Ｂ鼠Ｎ

）ＳＣｓ分化３ｄ后ＮＳＥ阳性表达细胞（ＡＢ，×４００Ｄ　　Ｃ鼠Ｎ

ＳＣｓ培养７ｄＮｅｓｔｉｎ＋ＢｒｄＵ阳性表达细胞　　Ｄ鼠传代Ｎ）（ＲＩＴＣ＋ＦＩＴＣ，×４００Ｔ

因素的影响，消化时间的延长可能会大大减少ＮＳＣｓ的数量，这些因素是难以把握的；机械分离法虽不会有这些生物损伤，但也存在着不可避免的问题，如吹打的力度和次数，同样影响细胞分离的效果，过小会导致细胞不易分散，过大易使细胞产生机械损伤。悬浮成球生长，并且随着时ＳＣｓ在培养的过程中，Ｎ

间的延长，神经球直径逐渐增大，而神经球内部的细

４］１

当胞营养摄取越来越少，逐渐变黄。有文献报道［

ＳＣｓ增殖及诱导分化鉴定　　图３　Ｎ

ｉ．３　Ｉｄｅｎｔｉｆｏｆｒｅｒｏｄｕｃｉｎａｎｄｉｎｄｕｃｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ　　Ｆ－　　ｙｐｇｇｇ　　　ｉｏｎｆｒｏｍ　ＮＳＣｓｏｆｒａｔｔ　　　

３　讨　论

３．１　ＮＳＣｓ培养条件的选择　以往的ＮＳＣｓ培养中

通常第一天直接采用无血清培养基培养，本实验第再换为一天先采用１０％血清培养基预培养２４ｈ后，

神经球直径长至１球心会因营养缺５０～２００μｍ时，

乏而出现坏死的细胞，此时，若不及时消化或传代，会导致神经球内大量细胞死亡。原代细胞培养过程

４３中国儿童保健杂志２０１４年０１月第２２卷第１期　ＣＪＣＨＣＪＡＮ．２０１４，Ｖｏｌ２２，Ｎｏ．１　　

？Ｗ？［］，（）：ＷｈｅｒｅｈＪ．Ｌ９２ａｎｃｅｔ００５，３６５９４６２９１００．８－ｙ

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］叶鸿瑁，丘小汕．实用新生儿学［４版．２０１１：Ｍ］．５　［　邵肖梅，

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ｃｅｌｌｓａｒｅｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅａｄｕｌｔｍａｍＭａｌｉａｎｓｉｎａｌｃｏｒｄａｎｄｖｅｎ－　　　　　　　　　　ｐｐ［］（）：ｔＪ　Ｎ７１ｒｉｃｕｌａｒｎｅｕｒｏａｘｉｓＪ．ｅｕｒｏｓｃｉ，９９６，１６２３５９９６０９．７－　

］，ｔｌ．Ｒｅｔｉｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅａ９ｒｏｅｅＶ，ＣｏｌｅｓＢＬＫ，ＣｈｉａｓｓｏｎＢＪ　　　　［　Ｔ　　　ｐｐ

］：２ＳｉｎｔｈｅａｄｕｌｔｍａｍＭａｌｉａｎｅｅ［Ｊ．ｃｉｅｎｃｅ，０００，２８７（５４６０）　　　　ｙ２０３２０３６．２－］郑淑荣，万虹，等．血清预培养促进ＮＳＣｓ的增殖１０　［　历俊华，

（）：［］中国康复理论与实践，３００５，１１５３９－４０．３Ｊ．２

］［］Ｔ１１ｓｍｂａｌｉｕｋＶＩ．ＨｕｍａｎｎｅｒｖｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＪ．ｓｉｔｏｌ　［　Ｔ　　　　　　ｙ

０１２，４６：７１０．８２Ｇｅｎｅｔ，－］，ｅａｔ１２ｔｌ．ＬｏｎｅｒｍｓｕｒｖｅｎｄｓｅｎＣＮ，ＣａｌｄｗｅｌｌＭＡ，ＳｈｅｎＪ　－－　　［　Ｓ　　　ｇ

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ｎｄｕｃｉｂｌｅｉｌｏｗｅｒｅｄｏｘｅｎａｎｄｔｈｅｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅｏｆｈｏｘｉａ－　　　　　　　ｙｇｐｙｐ［］（）：１Ｊ．ＡＮ２２ｆａｃｔｏｒｌｈａ　ｅｕｒｏｓｉｎａｌｓ，００６，１５５５９６５．２－－ｇ］，１４ｉｌｏｓｅｖｉｅＪＳｔｏｒｅｈＡ，ＳｅｈｗａｒｚＪ．Ｓｏｎｔａｎｅｏｕｓａｏｔｏｓｉｓｉｎ－　［　Ｍ　　　　　ｐｐｐ

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中，细胞结构较为松散，随着传代次数的增加，传代培养中的神进经球结构愈发致密，较难分离，考虑到以上方面，本实验则选择两种方法共用的消化方式，对于原代结构较松散的细胞则采用机械吹打法，对于传代中不易消化的神经球则采用低浓度胰酶消化和机械吹打相结合的方式分离细胞，即选用０．２５％胰蛋白酶消化，联合机械吹打法，这样可以尽量减少两种分离方法对细胞的损伤。

３　ＮＳＣｓ增殖分化的鉴定　ＮＳＣｓ的鉴定方法主３．

要是通过细胞标记物检测，ｅｓｔｉｎ是ＮＳＣｓ最常用Ｎ的的特异性神经抗原，属第Ｖｅｓｔｉｎ又称巢蛋白，ＩＮ类中间丝蛋白，分布于细胞质，是哺乳动物的主要细胞骨架蛋白。有研究认为Ｎｅｓｔｉｎ参与了神经突的生长及神经与靶细胞建立联系的过程，其表达具有特定的时序性

［１５］

，该蛋白仅在胚胎早期的神经上皮

表达，一旦神经前体细胞开始分化，ｅｓｔｉｎ便停止表Ｎ达，本文对体外分离培养的ＮＳＣｓ进行ＮｅｓｔｉｎＤＡＢ　染色，可见细胞集落的大部分细胞均被染成棕黄色。，Ｂ２ｄｒｏｍｏ＇ｅｏｘｕｒｉｄｉｎｅＢｒ５５－溴脱氧尿嘧啶核苷（－－－－ｙ

，为胸腺嘧啶的衍生物，可在ＤｄＵ）ＮＡ合成期（Ｓ期）发挥作用，但由于该抗体分子量大，检测前需用暴露抗原识别位点，使其在细胞Ｌ使ＤＮＡ变性，ＨＣ

增殖期代替胸腺嘧啶掺入正在复制的ＤＮＡ分子中，只要细胞为活体细胞，这种ＢｒｄＵ就会在胞核的根据这一原理行ＮＮＡ中长期存留，ｅｓｔｉｎ＋ＢｒｄＵＤ

免疫荧光双标检测，结果Ｎｅｓｔｉｎ标记的ＮＳＣｓ呈红色荧光，证实ｒｄＵ标记的细胞核呈绿色荧光，ＢＳＣｓ具有增殖功能。当加入血清培养基后，ＳＣｓＮＮ在血清的诱导下很快分化，本实验通过免疫细胞化神经元标记物）学检测，证明分化的细胞为Ｎ阳ＳＥ（星形胶质细胞标记物）性表达的神经元和Ｇ阳ＦＡＰ（性表达的星形胶质细胞，以上鉴定结果直接或间接表明我们所培养的ＮＳＣｓ具有增殖分化的潜能。

目前临床已将ＮＳＣｓ用于治疗新生儿缺氧缺血性脑病等缺血缺氧性脑损伤性疾病

［］１１６７－。通过

在临床上具有广泛的前景。ＳＣｓ移植治疗ＨＩＢＤ，Ｎ

［８］

研究发现Ｎｉｌｌ等１ＳＣｓ之所以能成为神经系统Ａ　Ｖ疾病细胞治疗的良好的种子，主要是因为细胞ＮＳＣｓ高表达端粒末端转移酶，能保持稳定的分化能力、有丝分裂潜能和神经元形成等能力。神经干细胞体外培养已经成为国内外研究的热点，为进一步基础和临床研究奠定了基础。

参考文献

，：？］ａｗｎＪＥ，ＣｏｕｓｅｎｓＳＺｕａｎＪ．４ｍｉｌｌｉｏｎｎｅｏｎａｔａｌｄｅａｔｈｓｗｈｅｎ１　　　　　　［　Ｌｐ

ｅｍＣＲ５２ｒｉｅｎｔａｌｅｌｌｅｓｅａｒｃｈ，００４，２９４：５５９６６．－　　－ｐ收稿日期：０１０１３６８２－－本刊网址：ｃｃｈｃ．ｎｅｔｗｗｗ．ｊ