固氮菌分离及其荚膜染色综合性实验

　　　　　　　　　　　　　　　　　/CN１１Ｇ２０３４TExerimentalTechnolondManaementpgyagVol．３５　No．１　Jan．２０１８

:/DOI１０．１６７９１．cnki．s．２０１８．０１．０１６　jjg

固氮菌分离及其荚膜染色综合性实验

樊　佳,林文和,郭子玮,董文捷,李蕊晗,耿　含,汪　红

()四川大学生物科学实验教学中心,四川成都　６１００６５

摘　要:采用直接分离法和梯度稀释法分离固氮菌,利用该中心改良的染色方法观察固氮菌的荚膜.通过综合性实验让学生掌握微生物分离技术和荚膜染色方法,并认识固氮球菌的形态特征,提升学生动手能力,为培养学生的创新思维奠定基础.

关键词:微生物学;综合性实验;固氮菌;荚膜染色

()中图分类号:G６４２．４２３;S１５４．３　　文献标识码:B　　文章编号:１００２Ｇ４９５６２０１８０１Ｇ００６６Ｇ０３

,,,,,,WFanJiaLinWenheGuoZiweiDonenieLiRuihanGenananongWjgHgHg

(,,)BioscienceExerimentalTeachinenterSichuanUniversitChendu６１００６５,ChinapgCyg

Comrehensiveexerimentofazotobactersearationppp

anditscasulestaininpg

,searatedbhedirectsearationmethodandgradientdilutionmethodandthecasuleofazotobacterispytpp,observedbtheimrovedstaininethodinthiscenter．Throuhthecomrehensiveexerimentstudentscanypgmgpp,masterthemicrobialsearationtechnolondcasulestaininethodandunderstandthemorholoicalpgyapgmpg

:,AbstractAzotobacterisnoteastobepreservedanditneedstobesearatedbeforeitisused．Azotobacterisyp

theirinnovativethinkin．g

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可以固　　固氮菌在自然界广泛分布于土壤和水中,

定转化空气中的氮气,是生物固氮的重要微生物资源,在自然界中的氮素循环起重要作用,可有效提高土壤固氮菌形态特征明显,经分离培养后,成对的菌体呈

１Ｇ５]

.的氮素,对增加粮食产量,具有巨大的现实意义[

要,可以锻炼学生对微生物实验的操作技能,培养学习兴趣.目前,在微生物教材中,未介绍固氮菌的分离方法,且固氮菌不易保藏,需实验教师临用前分离,学生无法知道实验菌的来源.为此,开设固氮菌分离及其荚膜染色综合实验,让学生自己分离菌株后,再进行染色和观察固氮菌的形态特征.目前教科书上的染色方法不易于学生掌握,成功率低,因此在荚膜染色方法上进行了改良,改良后成功率大大提高,学生易操作和观察.通过开设微生物综合性实验,不仅能提升学生的实验操作能力,还能考察学生对微生物所学知识的运用能力,激发学生的创新思维,并在微生物教学上获得学生的普遍好评.

“排列,在它的细胞壁外面有一层黏液状的物∞”

]６

——荚膜,.固氮菌在自然质—在染色后可清晰分辨[界中分布广泛,容易获取,染色后形态特征明显,是微生物教学中使用的常用菌种.

微生物学是一门实验性和应用性很强的学科,随着分子生物学、遗传学等学科的迅速发展,微生物的研因此,开设从土壤分离固氮菌和荚膜染色实验很有必

收稿日期:２０１７Ｇ０５Ｇ２２

７Ｇ９]

.究方法已成为生物学科研究的基本技术和手段[

１　仪器及器材

仪器:生化培养箱LRHＧ２５０A型,电子天平

高压灭菌锅L超净工作台BS２２４S型,DZXＧ３０KBS型,冰箱BSWＧCJＧ１F型,CDＧ３０１型.

)基金项目:大学生创新创业训练计划项目(２０１６１０６１１４３３

化学实验教学

,作者简介:樊佳(女,山西运城,硕士,实验师,主要从事生物１９８８—),通信作者:汪红(女,四川成都,高级实验师,主要从事微生物１９６１—):EＧmailwh００２００８＠１６３．com

实验的教学和科研工作．

器材:玻璃试管,培养皿,移液枪(５mL,１０００μL、、酒精灯、锥形瓶、三角推棒、接种环、２００μL、１０μL)

１􀆰５mLEP管.

　樊佳,等:固氮菌分离及其荚膜染色综合性实验

６７

２　实验材料及试剂

,无氮培养基:甘露醇(葡萄糖)１０gKH２PO．２４０

,,,,CaSO．２gNaCl０．２gCaCO．２gMSO．２gg４０３０４０实验试剂:齐氏石炭酸复红染液:混合A液及B

,液即成.A液:碱性复红０．３９５％乙醇１０mL;Bg,液:石炭酸５g蒸馏水９５mL.实验材料:新鲜土壤.

把多余的水吸掉,使载玻片表面留有少量水分;从载玻片一端滴加１轻轻晃动载玻~２滴黑色碳素墨水溶液,片,使黑色碳素墨水溶液均匀分布于载玻片上,然后对准日光灯光照,将载玻片上的多余黑色碳素墨水溶液用吸水纸吸掉,让光线能够透过即可;最后在３７℃左右的培养箱干燥后,油镜下观察菌体形态和荚膜特征.

,,琼脂２０g１０００mL蒸馏水,H７．２,１２１℃高压灭gp

.菌２０min

４　实验结果

４．１　直接法分离得到初步的固氮菌

将采集的土样按上述方法进行分离,结果显示可黑色碳素墨水溶液:黑色碳素墨水与蒸馏水体积比为３∶１.

　实验方法

．１　样品采集

铲取地表约于已灭菌的培养皿并送至实验室２~３cm土层,采集新鲜土壤.５g,置．２　固氮菌的分离

．２．１按无菌操作要求　直接法分离固氮菌

,在火焰上灼烧镊子灭菌,冷却后

夹取米粒大土壤,均匀放置在固氮培养基平板上,并加℃．１m正置培养箱中培养L无菌水在土壤上;１０min后,倒置放于２８

．２．２按无菌操作要求　梯度稀释法分离固氮菌

３d

.,取菌水中,振荡混匀后静置用移液枪吸取１５５mg新鲜土壤加入in,此液稀释度为５０m悬液于第一支１０

L无

－１

４．５;mL无菌水中,０此．５液m稀L土壤上清释度为菌液用移液０－３、１０

－４几种稀释度的土壤稀释液１０

－２

[７;]

以枪分别吸取０．２mL于无;氮将各稀释度的此类推制成培养基平板

上,将三角推棒在酒精灯火焰上充分灼烧灭菌;冷却后将悬液涂布均匀,正置箱中培养３d

.３min后,倒置放于２８℃培养

．３　纯化固氮菌观察２８℃培养３d的固氮菌分离培养平板,用接种环挑取透明状黏稠的褐色固氮菌可疑菌落于无氮培养基进行划线分离,然后倒置放于２８℃培养箱中培养

面培养基中~３d

;经过镜检后,在．４　固氮菌的荚膜染色

２８℃,再将纯化的固氮菌接种于固氮斜培养箱中培养２~３d备用.取一片干净载玻片,滴加一滴蒸馏水于载玻片中央,将接种环在酒精灯火焰上充分灼烧,冷却后挑取少量固氮菌(菌不宜多)于蒸馏水滴中,充分分散菌体;放在３７℃左右的培养箱干燥,干燥后滴加适量齐氏石炭酸复红原液染液,使其覆盖在固氮菌涂片表面,染色

~３min后,

用自来水缓慢冲洗染液至淡红,用吸水纸以得到初步分离的固氮菌(见图１

).图１　直接法分离得到初步的固氮菌

４．２　梯度稀释法分离得到初步的固氮菌

将采集土样按梯度稀释法进行分离后得到初步的固氮菌(见图２

)图２　梯度稀释法分离得到初步的固氮菌

由图光滑,分布较密集２可看出:稀释度为,部分菌落为浅褐色１０

－１

时,菌落黏稠,表面;稀释度为时,菌落黏稠,表面光滑,分布较稀疏,部分菌落为浅褐

１０

－２

色;稀释度为色菌落;稀释度１０

－３

为,菌落黏稠－,表面光滑,数量少,无褐少,无褐色菌落.

１０

４

,菌落黏稠,表面光滑,数量极３３３３０３１３２３２６８

实　验　技　术　与　管　理

４．３　固氮菌的纯化

将初步分离得到的固氮菌多次划线分离后得到纯).的固氮菌(见图３

采土壤前下过雨,则可直接取土样,并将样本直接放在无氮培养基中培养,省去土壤湿润及梯度稀释法分离步骤,操作简便快捷;如果采集的土壤为晴天且干燥,图３　划线分离纯化后的固氮菌

．４　荚膜染色

改良后的荚膜染色,黑色背景较均匀,固氮菌菌体呈红色,而荚膜不着色,可清晰地观察到菌体呈“排列,见图４.

∞”型图４　固氮菌荚膜染色

　讨论

在现有的微生物学实验课程中,细菌荚膜染色已作为微生物染色镜检技术中的一个重要组成部分被编入教学内容中.在实际教学过程中,现有课程体系多为分章节针对性训练,因此一般由教师提前为学生准备好菌种等材料,学生直接使用实验菌培养物进行染色操作和观察结果,因而学生对菌种来源不清楚.虽然微生物实验课程中也有细菌分离纯化等内容的训

练[７]

使课程内容过于片段化,但分离得到的细菌不会用于后续实验内容,降低了课程内容间的关联和,这样

技能训练的连续性.

开设的“从土壤中分离培养固氮菌及其荚膜染色”的综合实验,使学生亲自参与土壤采集、固氮菌的分离、纯化和荚膜染色等过程,并针对实验具体细节进行一系列的改良和优化.一是土壤采集的问题,固氮菌在干燥的土壤中不易存活,在实际课程开设过程中,若

则取样后将新鲜土壤用无菌水湿润,并放在无氮培养基中培养或采用梯度稀释法分离.二是分离时所用的无氮培养基平板要厚(体积约长时间保持土壤湿润,利于固氮菌的生长４０mL),培养时能够较.三是在染色过程中,采用平铺法代替原有的推片法,即轻轻晃动载玻片使黑色碳素墨水自然流动均匀铺开,在光线下呈均匀半透明黑为宜.该改良后的方法染色背景均匀,色度适中,不会破坏菌膜表面,学生容易观察到荚膜,新方法与传统的推片法相比,操作更简便、成功率

高、效果更好,提高了微生物教学实验的效率.

　结语

综合性实验不仅包括了原有的荚膜染色内容,还涉及到样品采集、培养基配制和细菌分离纯化等步

骤[９Ｇ１２

]知识的能力得到锻炼,且均由学生独立完成,为其以后从事科研课题研究打,使学生综合应用微生物

下坚实的基础.

通过开设固氮菌分离及其荚膜染色综合性实验,不仅提升学生的独立实验操作技能,而且培养了学生综合应用微生物知识的能力,激发学生对微生物学习的积极性和主动性.参考文献(References

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J．

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