（内部资料）
试剂配制
1、革兰氏染液
① 甲液：结晶紫：1.25g 95％酒精：50ml DH2O：450ml ② 乙液：Na2CO3：6.25g DH2O：500ml
③ 碱性碘液：I2：6.0g KI：12.0g NaOH（1mol/L）：270ml 待KI完全溶于DH2O，后，再加I2
④ 丙酮酒精液： 95％酒精：70ml 丙酮： 30ml
⑤ 碱性复红水溶液： 碱性复红：8g 95%酒精：100L DH2O：900m
2、抗酸染液（萋－尼） 1．石炭酸复红染液： （1）储存液
① 碱性复红液：碱性复红8g，加95%乙醇至100ml，充分振荡使复红溶解。
② 5%石炭酸水溶液：40～50℃水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸5g 溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml。
（2）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液10ml 与5%石炭酸水溶液90ml充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。
2．5%盐酸乙醇脱色液：35%浓盐酸5ml 与95%乙醇95ml 混合。 3．亚甲蓝复染液：
（1）储存液：亚甲蓝0.3g 溶于95%乙醇50ml 中，完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。 （2）亚甲蓝复染液：以蒸馏水5 倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06%，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。
3、甲基红试剂
① 甲基红：0.2g ② 95％酒精：300ml ③ DH2O：200ml 配制：
将甲基红称入乳钵内，加1mol/L NaOH 10ml左右（提高甲基红溶解度），碾磨，加入酒精300ml DH2O 180ml，混匀后，再加入1 mol/L HCL 10ml左右，中和其中的NaOH，最后试剂弱带酸性
4、靛基质试剂
① 对二甲氨基苯甲醛:5.0g ② 纯戊醇或正丁醇:75ml ③ 浓盐酸:25ml 配制：
浓盐酸要待对二甲氨基苯甲醛溶解于纯戊醇后，再一滴滴徐徐加入
5、伏－波（VP）试剂
甲液：a萘酚：6.0g 无水乙醇： 100ml 乙液：KOH：40g 肌酸：0..3g DH2O: 100ml 注：甲液应储存于棕色瓶中
5、100g/L去氧胆酸钠溶液
① 去氧胆酸钠：5g ② 0.1 mol/L NaOH：5ml ③ 溶解后加DH2O 45ml 于冰箱可保存半月有效。
6、氧化酶，细胞色素氧化酶
① 10g/L盐酸二甲基对苯二胺（或）四甲基对苯二胺）水溶液 ② 10g/L a－萘酚乙醇液
7、硝酸盐还原试剂
① 甲液：对氨基苯磺酸：0.8g 5mol/L醋酸：100ml ② 乙液： a－萘胺：0.5g 5mol/L醋酸：100ml
8、6g/L酚红指示剂
酚红：3g 1mol/L NaOH：10ml 1mol/L HCL：10ml DH2O：480ml 配制：将酚红放入乳钵内加NaOH研磨，加DH2O 280ml，无水乙醇200ml混匀后，加入HCL混匀。配好后液体应为透明橙红色。
染色
1、革兰氏染色法
试剂：①结晶紫 ②碳酸钠溶液 ③碱性碘液 ④丙酮酸酒精 ⑤碱性复红水溶液 方法：
1. 将标本均匀涂布于洁净玻片上，自然干燥，火焰微热固定
2. 滴加结晶紫（革兰甲液）和碳酸钠液（革兰乙液）各2滴，初染30秒钟，水洗。 3. 用碱性碘液2滴固定30秒钟，水洗
4. 用丙酮酸酒精脱色至无兰色脱落为止（约5－10秒），水洗。 5. 用碱性复红水溶液复染5秒钟，水洗待干镜检。 结果：
革兰氏染色阴性细菌在视野下呈淡红色。革兰氏阳性细菌呈深紫色 注意事项：
1. 涂片应均匀，厚薄适宜，应自然干燥后再加微热固定。以热而不烫手为易，过热易使细菌变形。
2. 脱色要至无兰色脱落为止。
3. 复染时间不可过长，以免细菌均染成G—菌。
4. 枯草杆菌，链球菌有时染成紫红色，是因为细菌繁殖代谢中有紫色嗜变性，不一定全是染色原因，所以要根据其菌体形态加以确定。
2、抗酸杆菌染色
试剂：①石碳酸复红溶液 ②盐酸酒精溶液 ③碱性美兰溶液 方法：
1. 加满石碳酸复红溶液在已固定德标本玻片上，加温2－3分钟，使染液即有蒸汽上升又不致沸腾，不时添加染液，以免在受热情况下干凅。
2. 倾出染液，以DH2O冲洗后用盐酸酒精溶液脱色，直至玻片无红色为止。 3. DH2O冲洗，用碱性美兰复染1分钟。 4. DH2O冲洗，待干镜检。 结果：
抗酸杆菌被染成红色，背景为兰色。结核、麻风杆菌为抗酸阳性（奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性）
3、庞氏染色法 试剂：庞氏染液 方法：
涂片经自然干燥后经火焰固定，滴加庞氏染液2滴，静染3－5分钟后，水洗，待干镜检。 结果：
双级体杆菌菌体呈淡兰色 两端级体呈深紫兰色 报告：
查见双级体杆菌或未查见白喉杆菌
4、墨汁染色查新型隐球菌 试剂：优质印度墨汁 方法：
取一滴优质印度墨汁或国产优质墨汁于洁净载玻片上，加入待检标本（液体标本需离心后取沉淀）一滴，与之混合，加盖玻片于底倍镜下，将出光调暗，观察菌体及其周围荚膜。 阴性结果：
在高倍镜下可见黑色背景中透明宽厚的荚膜，似晕轮，有较厚的细胞膜，有时可见生芽的。内有脂质颗粒析出。 注意：
要与白细胞区别。白细胞无芽出现象、无荚膜、细胞壁薄、无脂质颗粒析出。
5、细菌细胞壁染色法
用途：观察细菌细胞壁是否缺损
试剂：甲液：100g/L鞣酸水溶液 乙液：5g/L龙胆紫 方法：
用无菌生理盐水涂片，将细菌均匀涂布于玻片上，待其自然干燥后，滴加甲液固定15分钟，水洗，滴加乙液染色3分钟，水洗，自然干燥待检。 结果：
有细胞壁的细菌，周边染成紫色，内部无色，缺壁细菌染料可进入菌体，菌体被染成深紫色。 注意事项：
1. 所用菌种必须是新分离所得菌
2. 涂片需自然干燥，切勿在火焰上固定
6、鞭毛申云氏法（水法）
试剂： ①200g/L鞣酸 ②200g/L钾明矾 ③1：12饱和石碳酸 ④ 碱性复红酒精液
⑤ 应用液：取1，2，3，4液个2ml，2ml，5ml，1.5ml混匀,用滤纸过滤后备用 方法：
1. “训练”菌种：将菌种接种于软琼脂平皿中央（点种），37℃ 24h后取平板边缘扩散菌，再转软琼脂。反复几次（视情况而定）。
2. 取一洁净玻片，置于桌面，垫高一端，是与桌面呈15o角左右，用洁净滴管在玻片中央滴加一滴蒸馏水，用滴管顺玻片将液滴摸成卵圆形。
3. 用接种环挑取一定量平板边缘菌，轻轻乳化于玻片高的一端的液滴边缘，让其自然往下流动5分钟左右。
4. 轻轻将玻片放平，滴加与液滴同等量的应用，染色5分钟,用水沿一端（最好是从高的一端）轻轻冲洗，待干镜检。 结果：菌体呈深紫红色 鞭毛呈淡紫红色 注意事项：
1. 所用应用液必须新鲜配制，以配制后2－3天内使用为宜。所用器皿，特别是玻片必须洁净。
2. 所用代测菌应使用多次反复转种软琼脂后的新鲜菌种
3. 方法中3项的时间要严格掌握，此步的原理是用蒸馏水：这种低渗液渗入菌体内，使菌体，鞭毛都发生不同程度的膨胀，时间太长菌体易裂
正确选择需要鉴定的细菌
1、血培养：
主要病原菌：沙门菌，布氏杆菌，其它革兰阴性杆菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌
以下菌应视为非致病菌（除非>1次血培养分离出）：芽孢杆菌属，凝固酶阴性葡萄球菌，草绿色链球菌，棒状革兰阳性杆菌
2、脑脊液培养：
主要病原菌：B群β溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌
3、咽部标本培养（上呼吸道标本）： 主要病原菌：A群β溶血链球菌 选择性报告：溶血隐秘杆菌
咽炎中非致病菌：金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，卡他莫拉菌，α溶血链球菌，
所有革兰阴性杆菌，所有酵母菌
4、痰标本（下呼吸道标本）
主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌 非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌
5、尿培养
主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其它革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金黄色葡萄球菌
6、生殖道标本培养：
主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌，女性细菌性阴道病综合征，孕妇携带的B群β溶血链球菌
非病原菌：金黄色葡萄球菌，任何革兰阴性杆菌（包括大肠杆菌，变形杆菌），B群β溶血链球菌（仅为孕妇报告） 生殖道标本（女）：
阴道高位拭子：酵母菌，阴道毛滴虫，细菌性阴道感染 宫颈或宫颈内部：淋病奈瑟菌，沙眼衣原体，人乳头瘤病毒 肛门或直肠拭子：淋病奈瑟菌，B群链球菌（+阴道拭子）
7、脓，吸取物或组织标本:
主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，其它β溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其它革兰阴性杆菌
非致病菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量棒状革兰阳性杆菌
8、抽吸物组织标本的厌氧培养：
主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓性链球菌，其它β溶血链球菌，铜绿假单胞，其它革兰阴性杆菌，梭状芽孢杆菌，梭菌属，拟杆菌属，其它厌氧菌 非致病菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量棒状革兰阳性杆菌 9、粪便培养：
主要病原菌：沙门菌，志贺菌，弯曲杆菌，霍乱弧菌，副溶血弧菌，产毒性大肠杆菌，难辨梭菌（常规实验室检测不出）
常用的细菌鉴定
链球菌科（链球菌属和肠球菌属）的鉴定索引
G（椭圆，呈双、短链、长链）
触酶（-） α溶血 β溶血 γ溶血 菌落、菌体特征 胆汁七叶苷 胆汁溶菌试验 杆菌肽 CAMP 七叶苷 - + optochin（5ug） S 黄色素 + 草链 D群 A链 马尿酸钠 胆汁七叶苷 6.5%NaCl S(溶菌,>15) R + 肺链 胆汁七叶苷 B链 + - + - - - D群 G链 肠球菌属 D链 草绿链球菌群 D群 阿拉伯糖 甘露醇 山梨醇 乳糖 马尿酸钠 粪肠球菌 - + + + + 屎肠球菌 + + - + - 鸟肠球菌 - + + + - 坚韧肠球菌 - - - + -
PC
微球菌科细菌的鉴定索引
G（圆形，呈葡萄、双、四联状） + 触酶 - 微球菌科 链球菌科
菌落、菌体特征 葡萄糖发酵 - + 四联球菌 葡萄球菌属 玻片法血浆凝固酶 + - 金黄色葡萄球菌 试管法血浆凝固酶 甘露醇发酵
+ - 新生霉素（>16mm S） 尿素 麦芽糖发酵 表葡 腐葡 溶葡 新 S R S 尿 + + -
麦 + + +
PC
特殊细菌特点：
产单核李斯特菌：主要存在于脑脊液和血中的病原菌
规则的革兰阳性杆菌，长短不一，β溶血但溶血环不超过菌落边缘，触酶阳性，26℃有动力，35℃无动力
芽孢杆菌属：（主要病原菌：炭疽芽胞杆菌）规则革兰阳性杆菌&芽孢（不着色） 可能炭疽芽胞杆菌：生长迅速，不溶血，菌落粘在一起，无动力
伤寒沙门氏菌
标本采集：未使用抗生素前提下 第一周分离阳性 血液90% 粪便10% 第三周分离阳性 血液50% 粪便85% 尿25% 使用抗生素后：骨髓，玫瑰疹
药物敏感性
超广谱-内酰胺酶（ESBLs）： 克雷伯菌属，大肠艾希氏， 特点：质粒编码，非边界耐药（青霉素类，头孢菌素，氨曲南）；通常对抑制剂（棒酸、他巴唑、他唑巴坦）敏感。 治疗用药：碳青酶烯、抑制剂复合类或头霉素 AmpC -内酰胺酶： 肠杆菌属，枸橼酸杆菌属， 特点：染色体、质粒编码，诱导酶，非边界耐药（青霉素类，头孢菌素1，2，3代，头霉素）对抑制剂不敏感。 治疗用药：碳青酶烯，头孢4代
抗生素：
青霉素类抗生素
天然青霉素：青霉素G 青霉素V
不产青霉素酶的G+球菌和G-球菌
耐青霉素酶青霉素：苯唑西林 氯唑西林 奈夫西林 氟氯西林
产青霉素酶的G+菌和G-球菌 作用机制
青霉素类抗生素作用于细胞壁合成后阶段的酶
阻断肽聚糖合成的最后阶段—肽聚糖链的组装和三维结构的构建。 该阶段由下面几种酶催化完成：
转糖基酶、转肽酶、D-羧肽酶、内肽酶
不同β-内酰胺类抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用
头孢菌素类抗生素
第一代头孢菌素：头孢噻吩、头孢唑啉等 对G+菌有较强作用 第二代头孢菌素：头孢呋辛、头孢克洛等 对产β-内酰胺酶的G-杆菌有作用 第三代头孢菌素：头孢噻肟、头孢他啶等
对产β-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用 第四代头孢菌素：头孢吡肟、头孢匹罗等
对肠杆菌科细菌和铜绿假单孢菌作用强
头孢菌素类抗生素和青霉素结合蛋白结合,抑制细菌细胞壁合成。PBP位于质膜，不同的头孢菌素与不同的PBP结合，发生不同的效应，使菌形成丝状体或球体，最终溶解死亡。
其他β-内酰胺类抗生素
单环-内酰胺类抗生素：氨曲南 对G-杆菌作用强
头霉素类：头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑 对G+菌和产ESBLS有较好作用 氧头孢烯类：拉氧头孢-氧头孢烯类衍生物
对产β-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用，对产酶的金葡菌也有一定作用 碳青霉烯类抗生素：亚胺培南、美洛培南等
对G-杆菌（除嗜麦芽窄食单胞菌外）有很强的活性
β-内酰胺酶抑制剂- 与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性 克拉维酸 可从链霉菌培养液中分离得到 舒巴坦 半合成的酶抑制剂 他唑巴坦 半合成的酶抑制剂 青霉素+ β -内酰胺酶抑制剂
氨基糖苷类抗生素
链霉素 、卡那霉素 、妥布霉素 、核糖霉素 、巴龙霉素 、新霉素 庆大霉素 、福提霉素
阿米卡星、奈替米星、 地贝卡星
革兰阴性杆菌有强大的抗菌活性 ；革兰阴性球菌效果差；革兰阳性球菌有一定活性 大观霉素、丙大观霉素：淋病奈瑟菌敏感，解脲脲原体敏感
氨基糖苷类抗生素和细菌核糖体30S小亚基发生不可逆的结合，抑制MRNA的转录和蛋白合成；造成遗传密码子的错读，产生无意义的蛋白质；吸附在菌体表面，造成细胞膜的损伤，导致膜的渗漏，胞内的K+、腺嘌呤等物质外漏。
喹诺酮类抗生素
第一代喹诺酮类抗生素：奈啶酸等 大肠杆菌有作用
第二代喹诺酮类抗生素：环丙沙星、氧氟沙 星、诺氟沙星等 对G+菌和G-菌均有作用
第三代喹诺酮类抗生素（超广谱类抗生素）：左氧氟沙星、司帕沙星等 对G+菌（如MRS、PRSP、肠球菌）作用强于二代4-8倍 作用机制
作用于DNA旋转酶,干扰细菌DNA的修复和重组
大环内酯类抗生素
常用的有：红霉素、麦迪霉素等
主要用于G+菌，对苛养菌及厌养菌有作用，对衣原体、支原体、立克次体、螺旋体等有抑制作用
新一代大环内酯类抗生素：阿齐霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素等 较红霉素有更强的抗菌活性 作用机制
大环内酯类抗生素可逆结合在细菌核糖体50S大亚基的23S单位上,抑制肽酰基转移酶,影响核蛋白位移,抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。
四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素
四环素类抗生素 广谱抗生素 米诺环素 多西环素等
四环素类抗生素主要与细菌30S核糖体亚单位结合，阻滞氨酰基转移RNA与信使RNA核蛋白体的受位位点的结合，阻滞肽链延伸，抑制蛋白质合成。
氯霉素类抗生素 易进入脑组织 氯霉素 甲砜霉素
氯霉素主要作用于细菌70S核糖体的50S亚基，使肽链延长受阻而抑制蛋白质合成。
林可酰胺类抗生素 盐酸林可霉素 克林霉素 G+球菌、白喉杆菌、 破伤风 梭菌、厌氧菌、沙眼衣原体
林可酰胺类抗生素与细菌50S核糖体亚基结合，抑制蛋白质合成，并可干扰肽酰基的转移，阻止肽链的延长。
糖肽类抗生素
万古霉素 替考拉宁
对 G+球菌有强大的活性
多粘菌素B和E G-菌强大的活性
糖肽类抗生素与一个或多个肽聚糖合成中间产物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成复合物，可阻断肽聚糖合成中的转糖基酶、转肽基酶及D-D羧肽酶的作用
磺胺类药物及增效剂
用于全身感染，口服吸收好：磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪； 用于肠道，口服吸收差：柳氮磺胺啶银、磺胺二甲氧嘧啶； 局部应用：磺胺米隆、磺胺醋酰钠 作用机制
磺胺类药物分子结构中含有对氨基笨磺酰胺，能竟争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止氨基苯甲酸与二氢叶酸合成酶结合，使菌体内核酸合成重要物质辅酶F（四氢叶酸）钝化而导致细菌生长受到抑制。
甲氧苄胺嘧啶（TMP）能与二氢叶酸还原酶结合，抑制二氢叶酸还原酶，使二氢叶酸还原成四氢叶酸受阻而达到抑菌目的。
硝基呋喃类：用于肠道、尿路感染和外用
呋喃坦啶、呋喃唑酮
干扰细菌体内的氧化还原酶系统，阻断细菌的代谢，产生抑杀细菌的作用 硝基咪唑类：甲硝唑、替硝唑 用于厌氧菌
硝基咪唑类药物被厌氧菌还原而阻断DNA合成，从而阻止DNA的转录复制，导致细菌死亡。
替硝唑可干扰DNA合成，并能穿透细胞膜，快速进入细胞内。
（不断更新完善中）
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