响应面设计优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基

17响应面设计优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基

肖仔君，黄国清，钟瑞敏

(广东韶关学院英东食品科学与工程学院，广东

韶关

512005)

摘要：利用响应面分析法优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基。在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken中心组合试验设计，选定碳源、氮源和生长因子3个因素为响应因子,以乙醇脱氢酶的酶活为响应值建立二次回归方程,相关系数R2=0.9652,在分析各个因素的显著性和交互作用后,确定了醋酸杆菌产乙醇脱氢酶最优的培养基，即碳源15.1g/L、氮源7.0g/L、生长因子272.5mL/L,在此条件下，乙醇脱氢酶活力理论响应值为0.352U/mL,验证值为0.349U/mL。

关键词：醋酸杆菌Acetobactersp.CCTCCM209061；乙醇脱氢酶；响应面；培养基优化中图分类号：Q93-3；Q55

文献标识码：A

文章编号：1001－9286（2010）07－0017－04

OptimizationofFermentationMediumforAlcoholDehydrogenaseProduced

fromAcetobactersp.CCTCCM209061byResponseSurfaceMethodology

XIAOZi-jun,HUANGGuo-qingandZHONGRui-min

(FoodScienceandEngineeringCollege,ShaoguanCollege,Shaoguan,Guangdong512005,China)

Abstract:FermentationmediumforADHproducedfromAcetobactersp.CCTCCM209061wasoptimizedbyresponsesurfaceanalysis(RSA).Basedonsinglefactorexperiment,threefactorsincludingcarbonsource,nitrogensourceandgrowthfactorswereselectedasresponsefactorsbyuseofBox-Behnkencenter-compositeexperimentaldesignandenzymeactivityofADHwasusedasresponsevaluetoestablishthequadricre-gressioneuation(thecorrelationcoefficientR2=0.9652).TheoptimumfermentationmediumforADHproductionfromAcetobactersp.CCTCCM209061wasdeterminedasfollowsthroughtheanalysisofthesignificanceandtheinteractionofeachfactor:15.1g/Lcarbonsource,7.0g/Lni-trogensource,and272.5mL/Lgrowthfactor.Undertheaboveconditions,thetheoreticalvalueoftheenzymeactivityofADHwas0.352U/mLandtheverifiedvaluewas0.349U/mL.

Keywords:Acetobactersp.CCTCCM209061;alcoholdehydrogenase(ADH);responsesurface;fermentationmediumoptimization

乙醇脱氢酶(AlcoholDehydrogenase,ADH)是生物体内重要的氧化还原催化剂之一,是一种广泛专一性的含锌金属酶,能够催化乙醇氧化生成乙醛，乙醛经乙醛脱氢酶(Aldehydedehydrogenase，ALDH)继续氧化生成乙酸[1]。随着生物技术的发展，乙醇脱氢酶在生物催化、生物医学和工业生产等领域都有较为广泛的应用。例如，利用乙醇脱氢酶作为生物催化剂合成一些原料以及中间产物[2]；可以利用检测血清中乙醇脱氢酶的活性来诊断肝脏疾患[3]；利用含有乙醇脱氢酶的微生物进行果酒、果醋的生产[4-5]；在食品工业中，借助于乙醇脱氢酶氧化的产物乙醛与单宁作用，去涩退苦[6]。

目前，在动物、植物、微生物、真核生物以及原核细菌中都已发现醇脱氢酶，且在微生物中广泛存在。由于微生物的发酵周期短，培养基廉价，以及酶制剂可以实现大规模的生产，因此，从微生物细胞中提取ADH并制成酶制

收稿日期：2010－05－12

剂具有广阔的市场前景。

发酵培养基的优化是提高ADH产量、降低生产成本的重要途径之一。响应面分析法(RSA)是综合试验分析和数学建模最经济合理的试验，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的关系，对影响产量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价，并在一定的范围内求出最佳值[7]。本试验利用Box-Behnken响应面分析法对筛选得到的1株高产ADH的醋酸杆菌的培养基进行了优化。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株与培养基

菌株：醋酸杆菌（Acetobactersp.）CCTCCM209061，韶关学院英东食品科学与工程学院食品微生物教研室。

基金项目：广东省科技攻关项目（项目编号：2009B020312017），韶关市科技项目（项目编号）：韶科[2009]80。肖仔君（1973-），男，主要从事食品生物技术和生物催化与生物转化的研究。作者简介：黄国清。通讯作者：

18酿酒科技·2010年第7期（总第193期）LIQUOR－MAKINGSCIENCE＆TECHNOLOGY2010No．7(Tol．193)

基础培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨10g/L，pH6.0，

西红柿汁50mL/L(v/v)，于121℃灭菌20min。

斜面培养基：西红柿汁50mL/L(v/v)，琼脂15g/L，葡萄糖10g/L，酵母浸膏10g/L，蛋白胨10g/L，于121℃灭菌20min。1.1.2仪器和设备

超声波细胞粉碎机(JY92-Ⅱ，浙江宁波)；紫外可见分光光度计(721型，上海棱光)；超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州)、培养箱(PYX-250Z-B，科力)等。

胨与5g/L酵母浸膏），基础培养基中其他成分不变，按照5%的接种量将醋酸杆菌分别接入含有不同浓度西红柿汁的培养基中，30℃、150r/min培养24h，在600nm下测其OD值，并取50mL发酵液离心后，提取粗酶液，测其酶活，研究不同浓度的西红柿汁对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基的影响。

1.2.3

产乙醇脱氢酶培养基优化试验设计

在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken中心组合试验设计原理，选定碳源、氮源和生长因子3个因素为

1.1.3

试剂

酵母浸膏、蛋白胨购于广东环凯生物有限公司，其他试剂均为分析纯。

响应因子(表1)，乙醇脱氢酶的酶活为响应值，通过数据分析确定产乙醇脱氢酶最优培养基。

󰀁󰀂󰀃󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀃󰀁󰀂󰀆󰀅󰀎󰀅󰀐󰀅󰀃󰀄󰀅󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀅󰀏󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀅󰀑󰀒󰀓󰀔󰀉󰀕󰀌󰀋󰀌󰀖󰀗󰀋󰀗󰀍󰀅󰀘󰀙󰀅󰀚󰀛󰀜󰀅󰀚󰀛󰀜󰀅󰀙󰀜󰀜󰀅󰀜󰀅󰀙󰀝󰀛󰀚󰀅󰀞󰀛󰀚󰀅󰀝󰀜󰀜󰀅󰀙󰀅󰀝󰀜󰀛󰀜󰀅󰀙󰀜󰀛󰀜󰀅󰀟󰀜󰀜󰀅

1.2试验方法

1.2.1醋酸杆菌培养

将醋酸杆菌菌株接种于斜面基础培养基，在30℃恒温培养箱中培养48h，再将醋酸杆菌株接于液体基础培养基，于30℃恒温摇床中培养24h。

1.2.2醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的单因素试验

①不同碳源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响

分别用10g/L葡萄糖，5g/L蔗糖，5g/L麦芽糖和

1.2.4

5g/L乳糖替代基础培养基中的碳源，其他成分不变，以5%的接种量将醋酸杆菌分别接入各种不同碳源的培养基中，30℃、150r/min培养24h，在600nm下测其OD值，并取50mL发酵液离心后，提取粗酶液，测其酶活，

研究不同的碳源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基的影响。

②不同浓度的碳源(葡萄糖)对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基的影响

配制含不同浓度(2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L)的葡萄糖，基础培养基中其他成分不变，以5%的接种量将醋酸杆菌分别接入含有不同葡萄糖的浓度的培养基中，30℃、150r/min培养24h，在600nm下测其OD值，并取50mL发酵液离心后，提取粗酶液测酶活，研究不同浓度葡萄糖对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基的影响。

③不同氮源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响

分别用10g/L蛋白胨，10g/L酵母浸膏，混合氮源（5g/L蛋白胨与5g/L酵母浸膏、10g/L蛋白胨与10g/L酵母浸膏）替代基础培养基中的氮源，基础培养基中其他成分保持不变，以5%的接种量将醋酸杆菌分别接入各种含有不同氮源的培养基中，30℃、150r/min培养24h，在600nm下测其OD值，并取50mL发酵液离心后，提取粗酶液，测其酶活，研究不同的氮源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基的影响。

④不同浓度的生长因子对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基的影响

配制含不同浓度(0、50mL/L、100mL/L、200mL/L、300mL/L、400mL/L)的西红柿汁，混合氮源（5g/L蛋白

乙醇脱氢酶粗酶液的制备[8]

取培养对数期(24h)细胞培养液在3000r/min离心25min，沉淀用pH8.0、20mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤3次，收集湿菌体细胞。称取6g湿菌体细胞，以固液比为1∶5悬浮于pH8.0、20mmol/L的磷酸盐缓冲液，在冰水浴中进行超声破碎(200W、4s×90次、间隙5s)，再进行离心(6000r/min，15min，4℃)除去细胞碎片，细胞碎片再超声处理1次，同条件下离心，合并2次破碎离心后的上清液即ADH胞内粗酶液。合并后的上清液加入饱和度100%的硫酸铵溶液，得到40%～70%饱和度的硫酸铵溶液，在4℃下静置2h，将硫酸铵沉淀后的溶液离心(8000r/min，20min，4℃)。倒出上清液，沉淀用适量的0.1mol的磷酸缓冲液(pH7.4)溶解并装入已处理过的透析袋中，透析袋浸入0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.4)中，每隔1～2h换1次透析袋外的缓冲液，最好静置定容至50mL，测其蛋白质含量和ADH的活力。1.2.5乙醇脱氢酶活性的测定[7-8]

参照WOOD氏法,取0.5mLMcllvaine缓冲液pH4.0，10%TrironX-100溶液0.1mL，1.0mol/L乙醇溶液0.1mL，粗酶液0.2mL，0.1mol/L铁氰化钾溶液0.1mL于25mL比色管中，25℃保温5min，然后加入硫酸铁-Dupanol溶液0.5mL,加入3.5mL蒸馏水混合后，在25℃条件下放置20min(同时做空白对照)后，用722型紫外分光光度计测定660nm处光密度。

酶活力单位定义：在上述OD值条件下，1min氧化lμmol的乙醇为1个酶活力单位；4.0光密度等于氧化lμmol的乙醇。

22.1

结果与讨论

醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的单因素试验

肖仔君，黄国清，钟瑞敏·响应面设计优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶发酵培养基192.1.1

不同碳源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响

选用发酵工业常用的碳源，以相同的含碳量(1%)为标准，30℃培养24h，获得湿菌体细胞，破碎后测酶活，其结果表2。

󰀁󰀂󰀃󰀂󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒󰀓󰀔󰀂

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󰀁󰀂󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀌󰀍󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒󰀓󰀔󰀕󰀃󰀔󰀐󰀐󰀊󰀐󰀑󰀒󰀘󰀓󰀊󰀐󰀑󰀓󰀔󰀒󰀊󰀁󰀂󰀃󰀄󰀅Á󰀃󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀃ÂÂ

󰀓󰀐󰀐󰀊󰀐󰀑󰀒󰀘󰀗󰀊󰀐󰀑󰀓󰀔󰀘󰀊

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由表2中的结果可以得出，培养基中的碳源对醋酸

杆菌ADH的活性和菌体生物量的影响很大。以葡萄糖为碳源时，1mL发酵液中细胞酶活较高，菌液的OD值也相对高，因此，以葡萄糖作为碳源进行后续的研究。2.1.2不同浓度葡萄糖对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响

以葡萄糖为碳源时，控制培养基中起始碳源分别为2g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L，30℃培养24h，获得湿菌体细胞，破碎测酶活，其结果见表3。

2.2响应面法优化醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的培养基

响应面分析法是一种寻找多因素系统中最佳条件的

数学统计方法，其中最常用的是Box-Behnken的中心组合设计原理,根据此原理,以脱氢酶酶活为响应值选取葡萄糖、氮源（酵母浸膏∶蛋白胨按照1∶1的方式）和西红柿汁3个对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶影响较大的因素,设计了3因素3水平共17个试验点的响应面分析实验。其具体实验方案及结果见表6。

󰀁󰀂󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒󰀓󰀔󰀕󰀖󰀗󰀘󰀙󰀚󰀃

󰀁󰀂󰀃󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀍󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒󰀓󰀔󰀕󰀖󰀗󰀘󰀙󰀚󰀃󰀁󰀂󰀃󰀄󰀃󰀅󰀃󰀆󰀃󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀎󰀏󰀐󰀃󰀁󰀂󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍Á󰀋󰀎󰀏󰀆󰀐󰀈󰀑󰀉󰀊󰀋ÂÂ

󰀑󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀔󰀕󰀔󰀃

󰀒󰀋󰀓󰀔󰀕󰀖󰀗󰀋󰀓󰀔󰀘󰀙󰀕󰀋󰀖󰀃󰀒󰀃󰀗󰀑󰀃󰀑󰀃󰀒󰀓󰀔󰀔󰀖󰀃󰀗󰀋󰀓󰀔󰀚󰀙󰀛󰀋󰀓󰀔󰀘󰀜󰀙󰀋󰀔󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀔󰀕󰀖󰀃󰀘󰀓󰀋󰀓󰀔󰀗󰀚󰀒󰀋󰀓󰀔󰀒󰀓󰀖󰀋󰀕󰀃󰀑󰀃󰀗󰀑󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀔󰀑󰀔󰀃󰀘󰀗󰀋󰀓󰀔󰀗󰀖󰀕󰀋󰀓󰀔󰀒󰀓󰀙󰀋󰀘󰀃󰀑󰀃󰀒󰀃󰀑󰀃󰀒󰀓󰀔󰀕󰀑󰀃󰀒󰀓󰀋󰀓󰀔󰀗󰀖󰀙󰀋󰀓󰀔󰀒󰀓󰀛󰀋󰀙󰀃󰀗󰀑󰀃󰀑󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀖󰀚󰀑󰀃

󰀛󰀃󰀑󰀃󰀒󰀃󰀗󰀑󰀃󰀒󰀓󰀖󰀙󰀖󰀃

󰀜󰀃󰀒󰀃󰀑󰀃󰀑󰀃󰀒󰀓󰀔󰀖󰀖󰀃表3结果表明，在所考察的碳源浓度范围内，随着培

󰀚󰀃󰀗󰀑󰀃󰀗󰀑󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀖󰀕󰀔󰀃养基中碳源浓度的不断增大，醋酸杆菌在600nm下的

󰀑󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀔󰀕󰀙󰀃

OD值增大，但在碳源浓度为5～20g/L范围，1mL发酵

󰀑󰀑󰀃󰀗󰀑󰀃󰀒󰀃󰀑󰀃󰀒󰀓󰀖󰀜󰀔󰀃

液中的酶活变化不大。󰀑󰀖󰀃󰀑󰀃󰀑󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀔󰀒󰀑󰀃

󰀑󰀔󰀃󰀗󰀑󰀃󰀒󰀃󰀗󰀑󰀃󰀒󰀓󰀖󰀖󰀛󰀃2.1.3不同氮源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响

󰀑󰀕󰀃󰀒󰀃󰀑󰀃󰀗󰀑󰀃󰀒󰀓󰀖󰀚󰀙󰀃表4为不同氮源对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响结

󰀑󰀘󰀃󰀒󰀃󰀗󰀑󰀃󰀗󰀑󰀃󰀒󰀓󰀖󰀜󰀕󰀃

果，由表4可以看出，复合氮源比单一氮源对醋酸杆菌的

󰀑󰀙󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀔󰀔󰀑󰀃

OD600值和酶活的影响较大。󰀑󰀛󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀃󰀒󰀓󰀔󰀕󰀑󰀃

󰀁󰀂󰀃󰀄󰀅󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀌󰀍󰀎󰀏󰀐󰀑󰀒󰀓󰀔󰀕󰀃

根据实验结果，对实验数据进行多项拟合回归，以乙󰀁󰀂󰀃󰀄󰀅Á󰀃󰀆󰀇󰀈󰀉󰀊󰀋󰀌󰀍󰀃ÂÂ

󰀎󰀏 󰀐󰀊󰀌󰀑󰀒󰀓󰀃󰀏󰀔󰀕󰀖󰀗󰀃󰀏󰀔󰀗󰀏󰀘󰀃醇脱氢酶的比活力为因变量，以碳源葡萄糖、氮源（酵母󰀎󰀏 󰀐󰀊󰀌󰀙󰀚󰀛󰀜󰀃󰀏󰀔󰀕󰀘󰀝󰀃󰀏󰀔󰀗󰀎󰀏󰀃

浸膏∶蛋白胨为1∶1），生长因子西红柿汁为自变量建立回

󰀕 󰀐󰀊󰀌󰀑󰀒󰀓󰀞󰀕 󰀐󰀊󰀌󰀙󰀚󰀛󰀜󰀃󰀏󰀔󰀕󰀘󰀟󰀃󰀏󰀔󰀗󰀎󰀎󰀃

归方程：Y=0.32+0.022A+4.75×10-3B+0.026C-0.015󰀎󰀏 󰀐󰀊󰀌󰀑󰀒󰀓󰀞󰀎󰀏 󰀐󰀊󰀌󰀙󰀚󰀛󰀜󰀃󰀏󰀔󰀕󰀟󰀎󰀃󰀏󰀔󰀗󰀎󰀝󰀃

2.1.4

生长因子对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响

在前期的研究中，当培养基中添加西红柿汁时，对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶有较大的影响，因此，研究了培养基

中添加不同浓度的西红柿汁对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶活力的影响，结果见表5。

由表5可以看出，在所考察的西红柿汁添加量的范围内，随着西红柿汁添加量增加，600nm下醋酸杆菌的OD值随之增大，但与没有添加西红柿汁的相比，添加生

AB+5.75×10-3AC-5.500×10-3BC-0.042A2-0.012B2-0.02C2；并对回归方程进行方差分析，结果见表7。

该方程表达了脱氢酶酶活与所选的3个因素之间的关系。回归方程的决定系数R2为0.9652。当“Prob＞F”值＜0.05，即表示该项指标显著，“Prob＞F”值＜0.01，即表示该项指标高度显著。从表3的分析结果来看,乙醇脱氢酶与试验中3个因素的回归方程的F值为21.56，方程显著。整体模型的“Prob＞F”值＜0.001，表明该二次方程

模型高度显著。西红柿汁和葡萄糖对醋酸杆菌产乙醇脱

20酿酒科技·2010年第7期（总第193期）LIQUOR－MAKINGSCIENCE＆TECHNOLOGY2010No．7(Tol．193)

交互项中碳源与氮源交互显著，二次项中，碳源影响高度

显著，生长因子影响显著。在所选取的各因素水平范围内,按照对结果的影响排序为：西红柿汁＞葡萄糖＞氮源，同时，图1～3直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。比较3组图可知，生长因子（西红柿汁）对醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的影响最为显著,表现为曲线较陡;其次是碳源和氮源；失拟项p＞0.05，表明该方程可以接受，可以利用该回归方程确定最优的产乙醇脱氢酶的培养基成分。

2.3

醋酸杆菌产乙醇脱氢酶培养基成分的确定

通过软件Design-Expert7.0求解方程，给出了产乙醇脱氢酶最优培养基组成为：葡萄糖15.080g/L，氮源（蛋白胨和酵母浸膏）7.043g/L，西红柿汁272.500mL/L，此时醋酸杆菌中乙醇脱氢酶的酶活为0.352U/mL。考虑到实际操作的局限性,培养基中的各种成分修正为：葡萄糖15.1g/L，氮源（蛋白胨和酵母浸膏）7.0g/L，西红柿汁272.5mL/L。为检验结果的可靠性,将醋酸杆菌接入到修正后的培养基中于相同条件下培养,破碎细胞后，测其酶活为0.349U/mL，与理论预测值基本吻合。因此，可利用

响应面分析法得到乙醇脱氢酶。

3结论

图1响应面法(A,B)立体分析图

应用Box-Behnken中心组合实验设计方法,优化了醋酸杆菌发酵生产乙醇脱氢酶的培养基。结果表明，醋酸杆菌产乙醇脱氢酶的最优培养基为：葡萄糖15.1g/L，氮源（蛋白胨和酵母浸膏）7.0g/L，西红柿汁272.5mL/L。

参考文献：

[1]SunH.,PlappB.Progressivesequencealignmentandmolecular

evolutionoftheZn-containingalcoholdehydrogenasefamily[J].JournalofMolecularEvolution,1992,34(6)：522-535.[2]XiaoZ.,ZongM.,LouW.Highlyenantioselectivereductionof

4-(trimethylsilyl)-3-butyn-2-onetoenantiopure(R)-4-(trimethy-lsilyl)-3-butyn-2-olusinganovelstrainAcetobactersp.CCTCCM209061[J].BioresourceTechnology,2009,100(23)：5560-5565.

[3]胡建强,刘凤兰.血清乙醇脱氢酶活性测定及临床应用[J].天

津医科大学学报,2001,7(001)：110-111.

[4]徐晶,邓勇.山楂果醋发酵工艺的试验研究[J].中国农业大学

学报,2002,7(002)：81-84.

[5]周秉辰.食醋生产中醋酸菌乙醇脱氢酶的活性与产酸速率关

系的研究[J].中国酿造,2009,(011)：58-59.

[6]张海生,陈锦屏.柿饼加工中脱涩和反涩机理的研究[J].食品

工业科技,2003,24(012)：39-40.

[7]郝学财,余晓斌,刘志钰，等.响应面方法在优化微生物培养基

中的应用[J].食品研究与开发,2006,27(001)：38-41.

[8]潘丽军,余赟,郑志等.米根霉乳酸脱氢酶的特性研究[J].食品

科学,2003,24(011)：23-26.

图3

响应面法(B,C)立体分析图

氢酶影响高度显著,氮源（蛋白胨∶酵母浸膏）影响不显著,