一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 107084867 A(43)申请公布日 2017.08.22

(21)申请号 201710261618.7(22)申请日 2017.04.20(83)生物保藏信息

CGMCC No.12166 2016.04.11

(71)申请人 南京农业大学

地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇

国家农业科技园南京农业大学基地(72)发明人 沈其荣　刘东阳　苗嘉曦　陈兴　

李托　(74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任

公司 32218

代理人 傅婷婷　徐冬涛(51)Int.Cl.

G01N 1/28(2006.01)

(54)发明名称

一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法

(57)摘要

本发明公开了一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法。本方法的技术核心是结合玻璃珠机械破壁与细胞破碎缓冲液(SI)的方法，来破坏丝状真菌厚实坚韧的细胞壁并释放出胞内总蛋白，并在提取缓冲液(SII)和蛋白酶抑制剂的保护下提取到高质量的木霉固体发酵产物总蛋白。本发明采用了一种简单易行的方法，克服了丝状真菌细胞壁厚实坚韧、胞内蛋白难以释放，固体发酵物中高有机质和腐殖酸类物质的干扰，结合半透膜透析法可以直接从木霉固体发酵产物中提取到高质量的总蛋白，为固体发酵过程中丝状真菌蛋白质组学的研究提供技术保障。

权利要求书2页 说明书10页 附图2页

CN 107084867 ACN 107084867 A

权　利　要　求　书

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1.一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将丝状真菌固体发酵产物置于氧化锆内壁的球磨仪罐体中，加入提前预冷的裂解液SI和氧化锆球，涡旋均匀；加入DDT溶液后涡旋，然后进行冰浴，冰浴结束后于冷冻混合球磨仪上进行研磨；

(2)研磨结束后加入提取液SII，将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀后冰浴；冰浴结束后转移到球磨仪上进行研磨；

(3)将步骤(2)中研磨好的混合物转移到离心管中，4℃下离心；离心结束后，将上清转移到新的离心管中，并丢弃沉淀；

(4)将上清液进行冰浴后，按照1:4的体积比加入100％TCA溶液混合均匀，将混合液保存在-20℃条件下2小时，然后将其置于冰上直至液化；

(5)待上清液完全液化后，在4℃离心，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，除去多余的液体；往沉淀中加入提前预冷的丙酮，并用移液枪来回吸打将沉淀重悬浮于丙酮当中，将沉淀吹打混匀后，4℃离心，移除上层的液体；重复丙酮重悬-离心-弃上清的步骤2-5次，直到丙酮颜色不那么深后，移除上层丙酮，将多余的丙酮挥发干净，固体粉末即为丝状真菌固体发酵产物中的总蛋白，将固体粉末保存于-20℃。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的丝状真菌为木霉。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的丝状真菌为贵州木霉。4.根据权利要求1-3中任一项所述的提取方法，其特征在于所述的丝状真菌固体发酵产物是将丝状真菌接种于农业废弃物秸秆中进行固体发酵，待固体发酵基质中长满菌丝后停止培养，得所述的丝状真菌固体发酵产物；所述的农业废弃物秸秆选自水稻秸秆、小麦秸秆或玉米秸秆中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(1)中所述的SI溶液的配制方法为：8M尿素、2M硫脲、1mM EDTA、10mM PBS，0.1％Triton-X-100，充分溶解后4℃冰箱保存，使用前加入罗氏蛋白酶抑制剂cocktail；上述百分比浓度均为质量体积比浓度(w/v)。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(1)中所述的DDT溶液配制方法为：1.55gDTT用去离子水定容至10mL，-20℃保存备用；冷冻混合球磨仪工作程序设置为研磨净时间为10min，每2分钟暂停1分钟，研磨温度设置为4℃。

7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于步骤(2)中所述的SII溶液配方为：3％CHAPS、1％SDS、0.1％脱氧胆酸钠，0.2mg/mL BSA。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)称取培养好的丝状真菌固体发酵产物于清洗干净的球磨仪氧化锆内壁罐子，并加入提前预冷的裂解液SI中和0.5mm的氧化锆珠子；将罐体置于涡旋仪上，以1800-2200rpm/min将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀；打开罐体后入DDT溶液并涡旋2分钟，将罐体冰浴15min；冰浴结束后将罐体装在冷冻混合球磨仪上进行研磨；其中丝状真菌固体发酵产物与裂解液SI的质量体积比为1g：3-7mL；丝状真菌固体发酵产物与氧化锆珠子的质量比为1:0.8-1.2；丝状真菌固体发酵产物与DDT溶液的质量体积比为1g：3-7μL；

(2)研磨结束后将罐体置于冰上15min，打开罐体并加入提取液SII，将罐体置于涡旋仪上，以中速将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀，将罐体冰浴30分钟；冰浴结束后将罐体转移到球磨仪上进行研磨，研磨温度设置为4℃，研磨净时间为10min，每2分钟暂停1分钟；丝

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状真菌固体发酵产物与提取液SII的质量体积比为1.8-2.2g：1mL；

(3)将研磨好的混合物转移到清洗干净的离心管中，4℃8000rpm条件下离心10min；离心结束后，将上清转移到新的离心管中，并丢弃沉淀，总蛋白存在于上清液中；

(4)将上清液进行冰浴10分钟后，按照1:4(v/v)的比例加入100％TCA溶液并离心管上下颠倒使其充分混合均匀；将混合液保存在-20℃条件下2-4小时；冷冻时间到了以后，并将其置于冰上直至液化；

(5)待上清液完全液化后，在4℃8000rpm条件下离心10min；离心结束后弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，除去多余的液体；往沉淀中加入提前预冷的丙酮，并用移液枪来回吸打将沉淀重悬浮于丙酮当中，将沉淀吹打混匀后，在4℃8000rpm条件下离心10min，移除上层的液体；重复上述步骤3次，直到丙酮颜色不那么深后，移除上层丙酮，利用氮吹仪将多余的丙酮挥发干净，固体粉末即为固体发酵产物中的总蛋白，将固体粉末保存于-20℃。

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一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法

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技术领域

[0001]本发明属于生物科学领域，涉及一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法。背景技术

[0002]我国是一个农业大国，耕地面积占全球耕地面积的9％左右。近年来，我国传统农业向现代高效、集约化农业的转变为农业增产和农民增收提供了保障，但农用化学品(农药、化肥等)的大量施用也给农业生产带来了严重的问题。施用微生物有机肥是实现化肥减施、促进我国农业可持续发展的有效途径。植物根际栖息着大量的有益微生物，它们通过不同的方式促进植物根系生长并诱导植物产生防御反应，增强对外界环境的抵抗能力。研究发现木霉作为一种有益微生物广泛存在于土壤中，定殖于植物根部后能与植物形成共生体，通过分泌次级代谢产物和植物生长调节剂来促进植物的生长。研究发现哈茨木霉生物有机肥能够很好的促进植物的生长，通过优化贵州木霉的固体发酵参数、探究生物有机肥的作用，对于提高作物产量、改善作物品质具有重要的意义，并为实际生产提供理论依据。木霉是一种常用的生防菌剂，同时可以促进植物的生长，尤其对植物根系的促生具有显著的效果。近年来，益生木霉因其环境友好、安全无毒、寄生植物病原菌等优点作为微生物有机肥在国内外农业生产中逐渐得到广泛的应用，在促进植物生长及防控土传病害等方面取得了良好的效果。

[0003]在木霉的具体应用与生产过程中，生物防治与植物促生效果与其发酵工艺密切相关，发酵主要可以分为液体和固体发酵两种不同的工艺。液体发酵是用含有营养物质的液体培养基来发酵培养微生物的过程；而固体发酵是在一定含水率条件下，微生物在适合养分的固态基质上生长并产生代谢产物的过程。大量研究表明，固体发酵技术比液体发酵技术有更多的优点。首先，由于所用的固体基质养分更加充分，在产量、产能及产物的特性上都要大大优于液体发酵；其次，大部分的固体发酵都是利用低成本的农业或工农业副产物作为培养基质，大大降低了资金和操作成本；最后，固体发酵过程中，流动性较低，所需设备简单，同时，减少了液体发酵的下游工程带来的成本。[0004]蛋白质组学研究是针对特定环境、不同条件、不同细胞类型或特定生长发育阶段细胞及组织中表达的全部蛋白质，主要包括蛋白质的差异表达、功能蛋白鉴定和定量分析、翻译后修饰、生理功能及其相互作用网络等。蛋白质组学可以从总蛋白质的水平，更加准确的去发现和探讨生命活动的规律及其重要生理过程的本质。目前，蛋白质组学研究已经成为世界研究的热点，它不仅是后基因组时代研究的拓展，更是当今生命科学领域研究的核心内容。蛋白质组学研究涉及到的技术主要包括电泳技术、生物质谱技术，两者缺一不可。双向凝胶电泳技术(2D-PAGE)是应用最广泛的蛋白质分离技术，主要根据测试蛋白质中不同的等电点和分子量，使疏水性和相对丰度不同的总蛋白混合物得到充分的分离，此技术的优点在于它能够研究蛋白的翻译后修饰，但此技术的重现性不高而且容易导致蛋白丢失，对总蛋白的提取有较高的要求。iTRAQ技术(同位素相对标记与绝对定量技术)是近年来新开发出来的一种新的蛋白质组学定量研究技术，一般能够鉴定出500至600种蛋白，并定

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量出不同样品间蛋白质表达的差异，是目前应用最广的一种蛋白质组学研究的方法。生物质谱技术是通过测定样品的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析，是蛋白质鉴定的主要技术，它具有灵敏度高、准确性好且易于实现自动化等优点。[0005]随着科技进步与社会的发展，人类对真菌的研究日益增多，特别是在农业研究过程中被用于植物益生菌的木霉，在植物促生与生防方面具有重要的作用。但是，前期的大量研究紧停留在基因组与转录组水平，蛋白组水平研究进展缓慢，其中最重要的限制因子是很难获得高质量的总蛋白。与其他物种相比，丝状真菌的蛋白质组学研究还处于一个起步阶段，急需一种高效快速总蛋白提取方法来突破蛋白组学研究。发明内容：

[0006]本发明的目的是为了解决蛋白组学研究过程中，丝状真菌总蛋白提取的技术瓶颈问题，提供一种快速高效的丝状真菌发酵产物总蛋白的提取方法。[0007]本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0008]一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法，包括以下步骤：[0009](1)将丝状真菌固体发酵产物置于氧化锆内壁的球磨仪罐体中，加入提前预冷的裂解液SI和氧化锆球，涡旋均匀；加入DDT溶液后涡旋，然后进行冰浴，冰浴结束后于冷冻混合球磨仪上进行研磨；[0010](2)研磨结束后加入提取液SII，将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀后冰浴；冰浴结束后转移到球磨仪上进行研磨；[0011](3)将步骤(2)中研磨好的混合物转移到离心管中，4℃下离心；离心结束后，将上清转移到新的离心管中，并丢弃沉淀；[0012](4)将上清液进行冰浴后，按照1:4(v/v)的比例加入100％TCA溶液混合均匀，将混合液保存在-20℃条件下2小时，然后将其置于冰上直至液化；[0013](5)待上清液完全液化后，在4℃离心，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，除去多余的液体；往沉淀中加入提前预冷的丙酮，并用移液枪来回吸打将沉淀重悬浮于丙酮当中，将沉淀吹打混匀后，4℃离心，移除上层的液体；重复丙酮重悬-离心-弃上清的步骤2-5次，直到丙酮颜色不那么深后，移除上层丙酮，将多余的丙酮挥发干净，固体粉末即为丝状真菌固体发酵产物中的总蛋白，将固体粉末保存于-20℃。[0014]所述的丝状真菌优选木霉；进一步优选丝状真菌为贵州木霉。本发明所述的贵州木霉适用于所有的贵州木霉，尤其适用于具有促生作用，用于生产生物肥料的贵州木霉，如自行分离及市售的木霉生防菌株均适用于本发明方法；最优选适用于贵州木霉NJAU4742(Trichoderma guizhouense)，菌株保藏号为CGMCC No.12166。

[0015]所述的丝状真菌固体发酵产物是将丝状真菌接种于农业废弃物秸秆中进行固体发酵，待固体发酵基质中长满菌丝后停止培养，得所述的丝状真菌固体发酵产物；所述的农业废弃物秸秆选自水稻秸秆、小麦秸秆或玉米秸秆中的任意一种。[0016]本发明所述方法中，将秸秆烘干后，剪成1-2cm的小片段并用粉碎机粉碎成40目的粉末。称取10g不同的秸秆粉末于1L的大三角瓶中，然后往三角瓶中加入23mL配制好的Mandels盐溶液(初始含水率约70％)，等固形物和盐溶液充分混匀后将培养基在121℃下高温灭菌30min备用。

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步骤(1)中所述的SI溶液的配制方法优选：8M尿素、2M硫脲、1mM EDTA、10mM PBS，

0.1％Triton-X-100，充分溶解后4℃冰箱保存，使用前加入罗氏蛋白酶抑制剂cocktail；上述百分比浓度均为质量体积比浓度(w/v)。

[0018]步骤(1)中所述的DDT溶液配制方法优选：1.55gDTT用去离子水定容至10mL，-20℃保存备用；冷冻混合球磨仪工作程序设置为研磨净时间为10min，每2分钟暂停1分钟，研磨温度设置为4℃。

[0019]步骤(2)中所述的SII溶液配方为：3％CHAPS、1％SDS、0.1％脱氧胆酸钠，0.2mg/mL BSA。

[0020]本发明所述的提取方法，进一步优选包括如下步骤：[0021](1)称取培养好的丝状真菌固体发酵产物于清洗干净的球磨仪氧化锆内壁罐子，并加入提前预冷的裂解液SI中和0.5mm的氧化锆珠子；将罐体置于涡旋仪上，以1800-2200rpm/min将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀；打开罐体后入DDT溶液并涡旋2分钟，将罐体冰浴15min；冰浴结束后将罐体装在冷冻混合球磨仪上进行研磨；其中丝状真菌固体发酵产物与裂解液SI的质量体积比为1g：3-7mL；丝状真菌固体发酵产物与氧化锆珠子的质量比为1:0.8-1.2；丝状真菌固体发酵产物与DDT溶液的质量体积比为1g：3-7μL；[0022](2)研磨结束后将罐体置于冰上15min，打开罐体并加入提取液SII，将罐体置于涡旋仪上，以中速将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀，将罐体冰浴30分钟；冰浴结束后将罐体转移到球磨仪上进行研磨，研磨温度设置为4℃，研磨净时间为10min，每2分钟暂停1分钟；丝状真菌固体发酵产物与提取液SII的质量体积比为1.8-2.2g：1mL；[0023](3)将研磨好的混合物转移到清洗干净的离心管中，4℃8000rpm条件下离心10min；离心结束后，将上清转移到新的离心管中，并丢弃沉淀，总蛋白存在于上清液中；[0024](4)将上清液进行冰浴10分钟后，按照1:4(v/v)的比例加入100％TCA溶液并离心管上下颠倒使其充分混合均匀；将混合液保存在-20℃条件下2-4小时；冷冻时间到了以后，并将其置于冰上直至液化；[0025](5)待上清液完全液化后，在4℃8000rpm条件下离心10min；离心结束后弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，除去多余的液体；往沉淀中加入提前预冷的丙酮，并用移液枪来回吸打将沉淀重悬浮于丙酮当中，将沉淀吹打混匀后，在4℃8000rpm条件下离心10min，移除上层的液体；重复上述步骤3次，直到丙酮颜色不那么深后，移除上层丙酮，利用氮吹仪将多余的丙酮挥发干净，固体粉末即为固体发酵产物中的总蛋白，将固体粉末保存于-20℃。[0026]本发明所述方法中，离心后去除上清液时，一定要尽量将上清液移除干净，否则容易破坏蛋白沉淀，也会影响到蛋白的质量，如果液体为有机试剂时，尽量用氮吹仪将有机试剂清理干净；另一方面，用枪头吸取上清液时，不能吸到下层的沉淀；冰冷的丙酮中加入0.01％β-巯基乙醇，可以保护丝状真总蛋白不被氧化，但是绝对不能过量加入，过量会使蛋白质变性并处于不稳定转态，加速蛋白质的分解。[0027]有益效果：

[0028]本发明利用农业废弃物秸秆为基质，接种木霉后进行固体发酵，并利用机械破壁及合适提取剂相结合的方法，从固体基质中提取出高质量的木霉总蛋白，本发明的有益效果在于：[0029](1)本方法结合玻璃珠机械破壁与细胞破碎缓冲液(SI)的方法，可以充分的破坏

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丝状真菌厚实坚韧的细胞壁并释放出胞内总蛋白，可以大大提高蛋白的提取量。[0030](2)农作物秸秆接种木霉进行固体发酵后，基质中含有大量的有机质和腐殖酸类物质，本方法通过添加一定比例的表面活性剂(3％CHAPS、1％SDS)可以去除有机质和腐殖酸的干扰。[0031](3)本方法通过优化提取缓冲液(SII)的pH值并添加一定量的BSA，可以大大提高丝状真菌胞外蛋白和破壁后释放的胞内蛋白的回收率，为固体发酵过程中丝状真菌蛋白质组学的研究提供技术保障。[0032](4)在冷丙酮中添加0.01％β-巯基乙醇，可以保护胞内蛋白不被氧化，使得能够鉴定和定量出更多的丝状真菌总蛋白数量。

附图说明

[0033]图1不同提取方法提取的贵州木霉NJAU4742的总蛋白电泳图。M为标准蛋白marker；1泳道为常规方法一提取的蛋白电泳结果，2泳道为常规方法二提取的总蛋白电泳结果；3泳道为常规方法三提取的总蛋白电泳结果；4泳道为常规方法四提取的总蛋白电泳结果；5-1、5-2泳道为本发明所使用的方法提取的总蛋白电泳结果。

[0034]图2不同基质中贵州木霉NJAU4742发酵产物的总蛋白电泳图。M为标准蛋白marker；1泳道为本发明优化方法提取贵州木霉NJAU4742水稻秸秆发酵产物总蛋白；2为常规方法三提取贵州木霉NJAU4742水稻秸秆发酵产物总蛋白；3为本发明优化方法提取贵州木霉NJAU4742小麦秸秆发酵产物总蛋白；4为常规方法三提取贵州木霉NJAU4742小麦秸秆发酵产物总蛋白；5为本发明优化方法提取贵州木霉NJAU4742玉米秸秆发酵产物总蛋白；6为常规方法三提取贵州木霉NJAU4742玉米秸秆发酵产物总蛋白。[0035]图3贵州木霉NJAU4742的总蛋白二维电泳图。(水稻秸秆为发酵底物，本发明优化方法)图4贵州木霉NJAU4742的总蛋白二维电泳图。(水稻秸秆为发酵底物，传统方法三)[0036]生物材料保藏信息[0037]NJAU4742，分类命名贵州木霉(Trichoderma guizhouense)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年4月11日，菌株保藏号CGMCC No.12166。具体实施方式：

[0038]以下实施例以贵州木霉NJAU4742(Trichoderma guizhouense)为例举例说明本发明的技术方案，但并不因此限定本发明的保护范围。实际上，发明人按照本发明方法，以多种自行分离及市售的丝状真菌进行固体发酵产物总蛋白的提取，均获得了与本发明相似的效果，但鉴于专利公开充分的要求，以下仅以贵州木霉NJAU4742(Trichoderma guizhouense)为例，说明本发明的丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取总蛋白的提取。[0039]本实例中所使用的试剂罗列如下，所有试剂均从正规的试剂公司购买：[0040]尿素(U0631，SIGMA)、硫脲(T7750，SIGMA)、EDTA(798681，ALDRICH)、Triton-X-100(T9284，SIGMA-ALDRICH)、蛋白酶抑制剂(罗氏蛋白酶抑制剂cocktail)、CHAPS(226947，ALDRICH)、SDS(74255，SIGMA)、BSA(D0565，SIGMA)、脱氧胆酸钠(D6750，SIGMA-ALDRICH)；IPG预制胶条(美国Bio-Rad公司)，ReadyStrip IPG Strips,pH 4-7,7cm,163-2001-20℃冰

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箱保存；载体两性电解质(美国Bio-Rad公司)，Bio-Lyte 3/10Ampholyte，40％，10ml,163-1112，4℃冰箱保存；蛋白定量试剂盒Protein Assay Kit II。[0041]实施例1 贵州木霉NJAU4742分生孢子的制备及固体发酵[0042]1.贵州木霉NJAU4742简介

[0043]本发明所使用的菌株为贵州木霉NJAU4742(Trichoderma guizhouense)，该菌株进化上属于哈茨木霉分支，菌丝能够强重寄生灰葡萄孢菌、交链格孢菌、核盘菌、立枯丝核菌、齐整小核菌和尖孢镰刀菌；同时，可以很好的定殖于土壤和植物根际，促进植物生长，抑制植物病害发生，提高农作物的产量。[0044]2.分生孢子的制备

[0045]将活化的贵州木霉NJAU4742菌种接种到装有50ml固体PDA培养基的250ml的三角瓶中，然后在50℃条件下培养3-4天后，无菌条件下加入10ml高温灭菌的0.9％的NaCl溶液，120rpm约30min后，用两层无菌纱布过滤除去菌丝及孢子囊，并用血球计数板统计孢子悬液里面的孢子浓度。

[0046]3.贵州木霉NJAU4742的固体发酵[0047]将水稻秸秆烘干后，剪成1-2cm的小片段并用粉碎机粉碎成40目的大小，称取10g水稻秸秆粉于1L的大三角瓶中，然后往三角瓶中加入23mL配制好的Mandels盐溶液[0.3g·L-1urea，1.4g·L-1(NH4)2SO4，2.0g·L-1KH2PO4，0.3g·L-1CaCl2，0.3g·L-1MgSO4，0.25g·L-1酵母膏，0.75g·L-1蛋白胨，5mg·L-1FeSO4·7H2O，20mg·L-1CoCl2，1.6mg·L-1MnSO4和1.4mg·L-1ZnSO4]。等固形物和盐溶液充分混匀后将培养基在121℃下高温灭菌30min备用。[0048]将制备好的贵州木霉NJAU4742孢子悬液，按照107cfu/g dw的接种量接种到制备好的固体发酵培养基中。接种完后，将三角瓶置于28℃的恒温培养箱中静置避光培养，培养时间为5-7天，该固体发酵产物将用于后续总蛋白的提取。[0049]实施例2 不同方法提取贵州木霉NJAU4742固体发酵产物中的总蛋白[0050]2.1常规真菌总蛋白提取方法一

[0051]在液氮冷冻条件下利用研钵快速将贵州木霉NJAU4742固体发酵产物研磨成均匀的粉末，取2g研磨好的粉末转移到干净的50mL的离心管中，加入10mL裂解液中(20mM Tris-HCl pH 7.4，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％Sodium deoxycholate，0.1％SDS，蛋白酶抑制剂混合物)，冰上孵育1h，期间每隔5min颠倒混匀，4℃、24 000r/min离心30min后取上清，上清即为提取的总蛋白，上清液中蛋白浓度如表1所示，电泳结果如图1所示。[0052]2.2常规真菌总蛋白提取方法二

[0053]在液氮冷冻条件下利用研钵快速将贵州木霉NJAU4742固体发酵产物研磨成均匀的粉末，取2g研磨好的粉末转移到干净的50mL的离心管中，加入10mL裂解液中(50mM Tris-Hcl，1mM EDTA，50mM NaCl，0.1％Triston X-100，1mM DTT，1mM PMSF，pH8.0)，将体系进行混合；冰浴30min，期间每隔5min混匀一次，并用超声波细胞破碎仪在冰浴中破碎菌体(750W，超声6s，间隔1s，超声20次)；超声结束后，在4℃，12000rpm条件离心20min，离心结束后，小心的取出上清液，上清即为总蛋白溶液，上清液中蛋白浓度如表1所示，电泳结果如图1所示。

[0054]2.3常规真菌总蛋白提取方法三

[0055]在液氮冷冻条件下利用研钵快速将贵州木霉NJAU4742固体发酵产物研磨成均匀

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的粉末，取2g研磨好的粉末转移到干净的50mL的离心管中，加入预冷的10％TCA-丙酮溶液(含20mM DTT)，混匀后-20℃放置过夜。于4℃、13400r/min离心25min，弃上清，向沉淀中再加入预冷的丙酮溶液(含20mmol/L DTT)1mL洗涤，4℃、12000r/min离心25min，弃上清，重复2次。将沉淀室温风干，沉淀干燥成细粉。加入含有尿素、硫脲的双向电泳样品裂解液400μL，室温浸提2h，样品溶液4℃、13 400r/min离心20min，上清即为总蛋白溶液，上清液中蛋白浓度如表1所示，电泳结果如图1所示。[0056]2.4常规真菌总蛋白提取方法四

[0057]在液氮冷冻条件下利用研钵快速将贵州木霉NJAU4742固体发酵产物研磨成均匀的粉末，取2g研磨好的粉末转移到干净的50mL的离心管中，随后加入300mg蜗牛酶、100mg纤维素酶和1M的DDT100μL，再加入25mM磷酸缓冲液(pH7.9)至总体积20mL，用涡旋仪充分混合后37℃水浴3h。4℃，12000rpm离心5min后弃上清，重复2次后将多余的酶去除；加入裂解液(8M尿素、200mM碳酸钠)400μL，混合均匀后冰山孵育20min，将样品4℃、12000r/min离心25min，上清即为总蛋白溶液，上清液中蛋白浓度如表1所示，电泳结果如图1所示。[0058]2.5本发明真菌总蛋白提取方法

[0059]称取2g培养好的贵州木霉NJAU4742固体发酵产物于清洗干净的球磨仪氧化锆内壁罐子(50mL)，并加入10mL提前预冷的裂解液SI中和2g 0.5mm的氧化锆珠子；将罐体置于涡旋仪上，以2000rpm/min将固体基质与氧化锆珠混合均匀；打开罐体后入10μL DDT溶液并涡旋2分钟，将罐体冰浴15min；冰浴结束后将罐体装在冷冻混合球磨仪(德国莱驰，MM400)上进行研磨。研磨结束后将罐体置于冰上15min，打开罐体并加入1mL提取液SII，将罐体置于涡旋仪上，以中速将固体基质与氧化锆珠混合均匀，将罐体冰浴30分钟；冰浴结束后将罐体转移到球磨仪上进行研磨，研磨温度设置为4℃，研磨净时间为10min，每2分钟暂停1分钟。将研磨好的混合物转移到清洗干净的50mL的离心管中，4℃8000rpm条件下离心10min；离心结束后，将上清转移到新的离心管中，并丢弃沉淀；将上清液进行冰浴10分钟后，按照1:4(v/v)的比例加入100％TCA溶液(500g TCA加入到227mL去离子水中，4℃保存)并离心管上下颠倒混合均匀，使其充分混合均匀；将混合液保存在-20℃条件下4小时；冷冻时间到了以后，并将其置于冰上直至液化，不宜人为的加热助溶；待上清液完全液化后，在4℃8000rpm条件下离心10min；离心结束后弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，除去多余的液体；往沉淀中加入1mL提前预冷的丙酮(色谱纯，使用前加入0.01％β-巯基乙醇，保护胞内蛋白不被氧化)，并用1mL的移液枪来回吸打将沉淀重悬浮于丙酮当中，尽量不要用很大的力气，使得混合液尽量均匀。将沉淀吹打混匀后，在4℃8000rpm条件下离心10min，移除上层的液体(千万不能将下层的沉淀移除)；重复上述步骤3次，直到丙酮颜色不那么深后，移除上层丙酮，将沉淀溶解于400mL的PBS(pH6.0)溶液当中，上清即为总蛋白溶液，上清液中蛋白浓度如表1所示，电泳结果如图1所示。

[0060]表1不同蛋白提取方法提取贵州木霉NJAU4742固体发酵产物中总蛋白结果

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*蛋白质含量为mg·g-1dw,表示的是每克干发酵产物中提取到的总蛋白量。

[0063]实施例3 贵州木霉NJAU4742在水稻秸秆、小麦秸秆和玉米秸秆中固体发酵产物中总蛋白的提取结果的比较

[0064]3.1贵州木霉NJAU4742的固体发酵[0065]将不同的秸秆(水稻秸秆、小麦秸秆和玉米秸秆)烘干后，剪成1-2cm的小片段并用粉碎机粉碎，称取10g不同的固体发酵基质于1L的大三角瓶中，然后往三角瓶中加入配制好的Mandels盐溶液(配制方法见实施例1)。等固形物和盐溶液充分混匀后将培养基在121℃下高温灭菌30min备用。

[0066]将制备好的贵州木霉NJAU4742孢子悬液，按照107cfu/g dw的接种量接种到制备好的固体发酵培养基中。接种完后，将三角瓶置于28℃的恒温培养箱中静置避光培养，发酵时间为5-7天，该固体发酵产物将用于后续总蛋白的提取。

[0067]3.2贵州木霉NJAU4742在不同秸秆上发酵产物的蛋白提取

[0068]贵州木霉NJAU4742不同秸秆的固体发酵产物的前处理按照实施例2中的方法进行；培养结束后，按照实施例2中本发明方法提取贵州木霉NJAU4742在不同秸秆上发酵物的总蛋白，并以常规真菌总蛋白提取方法三作为对比。

[0069]3.3贵州木霉NJAU4742在不同秸秆发酵产物上蛋白质的定量与SDS-PAGE分析

[0070]分别用实施例2中常规真菌总蛋白提取方法三和本发明方法提取贵州木霉NJAU4742发酵物总蛋白，分别比较两者的提取效率，提取结果如表2所示。进一步采用SDS-PAGE的方法，来直观的观察不同处理中蛋白的提取效果，电泳结果如图2所示，图中每个泳道上样量都是10μL(等体积不等蛋白总量)。结合蛋白提取溶度和SDS-PAGE电泳结果，从图中可以得知，本发明的方法提取贵州木霉NJAU4742固体发酵物的总蛋白的效果更好，其中小麦秸秆发酵物中的总蛋白量高达10.34mg·g-1dw；而常规真菌总蛋白提取方法三在提取小麦秸秆发酵物时获得最大的蛋白浓度(4.78mg·g-1dw)，本方法提取的总蛋白是常规方法三提取的总蛋白的2.16倍，进一步说明本方法改进后的总蛋白提取量显著上升。[0071]表2不同蛋白提取方法提取贵州木霉NJAU4742在水稻秸秆、小麦秸秆及玉米秸秆固体发酵产物中总蛋白结果

[0062][0072]

[0073]

*蛋白质含量为mg/g dw,表示的是每克干发酵产物中提取到的总蛋白量。

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实施例4 不同提取方法提取的贵州木霉NJAU4742小麦秸秆固体发酵产物总蛋白

的双向电泳分析

[0075]由于采用本发明方法提取的贵州木霉NJAU4742小麦秸秆固体发酵产物中总蛋白质量最高，故采用双向电泳的方法来比较本发明方法和常规方法三提取的贵州木霉NJAU4742小麦秸秆发酵产物中的总蛋白，双向电泳的具体过程如下：[0076]1、第一向等电聚焦[0077](1)从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT，不含Bio-Lyte)1小管(1mL/管)，置室温溶解；在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5μL，充分混匀后从小管中取出400μL水化上样缓冲液，加入100μL样品，充分混匀。[0078](2)从冰箱取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4-7)，于室温放置10分钟；沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品；在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布；当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。[0079](3)分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触；不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收；同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡；如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。[0080](4)在每根胶条上覆盖2-3mL矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上，对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序如下：

[0081]

选择所放置的胶条数；设置每根胶条的极限电流(50-70A/根)；设置等电聚焦时的温度(16℃)。聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。[0083]2、第二向SDS-PAGE[0084](1)配制10％的丙烯酰胺凝胶[0085]配80mL凝胶溶液，每块凝胶40mL，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。

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(2)配制胶条平衡缓冲液I

[0087]在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5mL胶条平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。[0088](3)配制胶条平衡缓冲液II[0089]第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。[0090]用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。将琼脂糖封胶液进行加热溶解。将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。将IPG胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。[0091](4)将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面)。[0092]3、双向电泳结果比较分析

[0093]分别将本发明方法提取的贵州木霉NJAU4742在小麦秸秆发酵物的总蛋白和传统方法三提取的贵州木霉NJAU4742在小麦秸秆发酵物的总蛋白进行双向电泳检测，结果如图3和图4所示。从传统的方法三中提取的真菌总蛋白大概在300多个蛋白点，而本发明发法提取的真菌700多个蛋白点，而且蛋白分离的效果更好，如果结合现在高分辨度的蛋白组学研究方法(iTRAQ，SWATH等)，鉴定的蛋白数量将更多。从固体发酵产物中提取总蛋白，本身的难度就比在液体发酵条件下和纯培养条件提取丝状真菌总蛋白的难度要大，特别是以秸秆类为固体发酵基质，这类发酵基质在发酵过程中被丝状真菌分解，释放出大量含有色素的多酚类物质和腐殖酸类物质，即使在有蛋白酶抑制剂保护作用下，胞内蛋白释放后也很容易被分解掉，所以与提取液体发酵和纯培养条件下的菌丝总蛋白相比会偏少。由于固体发酵更接近于丝状真菌实际的代谢过程，为了研究丝状真菌固体发酵过程中的关键代谢过程，必须提取优质的总蛋白。同时，本发明提取丝状真菌总蛋白的方法简单易行，不需要复杂的仪器设备和昂贵的试剂，而且也适用于其他的木霉属丝状真菌固体发酵总蛋白的提

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取，为木酶属丝状真菌固体发酵过程中的蛋白组学研究提供了一种优质高效的总蛋白的提取方法。

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

图4

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