第３３卷第４期 云南中医学院学报 Ｖ０ｌ＿３３ Ｎｏ．４ ２０１０年８月 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８．２０１Ｏ 猪牙皂多糖提取工艺及体外抗氧化活性的研究 赵声兰 ，陈进伟 ，刘 芳 ，罗立梅 ，李时琪 ，佘仕继 （１．云南中医学院，云南昆明６５０５００；２．昆明理工大学，云南昆明６５０２２４） ［摘要］目的：研究猪牙皂多糖的提取工艺条件及其抗氧化活性。方法：在对时间、温度、料液比进行单 因素试验的基础上，采用正交试验优化猪牙皂多糖的提取工艺条件。抗氧化活性的研究采用邻苯三酚自氧化法。 结果：料液比（Ａ）、提取温度（Ｂ）、提取时间（Ｃ）对猪牙皂多糖提取影响的顺序为Ａ＞Ｂ＞Ｃ。适宜的提取工 艺条件为料液比１：２５、温度９０℃、时间６０ｍｉｎ。０．９ ｇ／ｍＬ的猪牙皂多糖溶液可消除５０％的超氧自由基（即 ＣＣ 。＝０．９ｐ￣ｇ／ｍＬ），对羟自由基（・ＯＨ）清除的ＣＣ 。＝１．７４ｍｇ／ｍＬ。结论：猪牙皂多糖具有较强的清除超氧自 由基和羟自由基的作用。 ［关键词］猪牙皂；粗多糖；提取工艺；抗氧化 中图分类号：Ｒ２８４．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１０００－－２７２３（２０１０）０４—ｏ０ｌ５—０４ 猪牙皂（Ｆｒｕｃｔｕｓ Ｇｌｅｄｉｔｓｉａｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｓ）系豆科 ２．１．１ 提取时间对猪牙皂多糖提取量的影响 苏木亚科皂荚属（Ｇｌｅｄｉｔｓｉａ Ｌｉｎｎ．）植物皂荚 精确称取猪牙皂５．００ ｇ于圆底烧瓶中，在料 （Ｇｌｅｄｉｔｓｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌａｍ．）的干燥不育果实，２００５版 液比１：１５，温度１００￣Ｃ条件下考察提取时间对粗多 《中国药典》收载为常用中药之一。性辛、咸、 糖提取量的影响，结果见图１。 温，归肺、大肠经，具有祛痰开窍、消肿散结、抗 ｎ５ｏ 炎、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒和改善心肌缺血等作 ｏ．４５ ｎ４０ 用，用于中风口噤、昏迷不醒、癫痫痰盛、关窍不 ０．３５ 通、喉痹痰阻、顽痰喘咳、咯痰不爽、大便燥结、 ｎ ３０ 外治痈肿 ｌ Ｊ。本文对猪牙皂多糖的提取工艺及抗氧 螽０・２５ Ｑ２０ 化活性进行研究，为猪牙皂的综合利用奠定基础。 ｏ．１５ １材料及方法 Ｑ １Ｏ １．１ 原料 ０．ｏ５ 猪牙皂购于昆明中药材市场，经去籽、粉碎、 Ｏ ０ ３０ 右０ ９０ ｌ２０ １５０ ９５％乙醇抽提３次，干燥备用。 ｔｈｎｉｌｌ １．２ 方法 图１提取时间对猪牙皂多糖提取量的影响 粗多糖提取采用水提醇沉法 Ｊ，脱蛋白采用 由图１可知，在料液比为１：１５，温度１００ｃｃ条 Ｓｅｖａｇｅ法 ３ Ｊ，多糖含量的测定采用苯酚一硫酸 件下，粗多糖提取量随提取时间的增加而增加，但 法 ，总蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法 Ｊ， 提取时间超过８０ｍｉｎ后，粗多糖提取量基本不变。 抗氧化活性的测定采用邻苯三酚白氧化法 测定 ２．１．２料液比对猪牙皂多糖提取量的影响 猪牙皂多糖对超氧自由基的清除活性。 精确称取猪牙皂５．ＯＯｇ于圆底烧瓶中，在提取 ２结果与讨论 时间８０ｍｉｎ，温度１００ 条件下考察不同的料液比 ２．１单因素试验 对猪牙皂多糖提取量的影响，结果见图２。 ・基金项目：国家自然基金项目（３０７６０３０４）和云南省科学基金项目（２００６Ｃ００４６Ｍ） 收稿日期：２０１０—０６—２７ 修回日期：２０ｌ０—０７一ｌ４ 作者简介：赵声兰（１９６２一），女，云南人，教授，主要研究方向：生物资源开发与利用。 ｌ５ 云南中医学院学报 第３３卷 Ｑ ７０ ｎ６５ 在上述单因素试验的基础上，采用Ｌ。（３ ） 三因素三水平正交试验 ’ 和平行重复试验的方法， ０．６０ ０．５５ ０．５０ 优化猪牙皂多糖的提取工艺条件，试验的因素水平 见表１，正交试验结果见表２，方差分析见表３。 ０．６０ Ｏ．５５ ４５ ｌｂ 曲 ＿０．５Ｏ ≤０．４５ 图２料液比对猪牙皂多糖提取量的影响 。一４ｏ 由图２可知：在温度１００℃加热提取８０ｍｉｎ的 条件下，多糖提取量随料液比的增加而增加，但料 液比大于１：２５后，多糖提取量的增加很小。 ０．３５ 温度／℃ ２．１．３ 提取温度对猪牙皂多糖提取量的影响 精确称取猪牙皂粗粉５．Ｏ０ ｇ于圆底烧瓶中， 图３提取温度对猪牙皂多糖提取量的影响 在料液比１：３０，加热提取８０ｍｉｎ的条件下，考察 不同的提取温度对猪牙皂多糖提取量的影响。结果 见图３。 表１因素水平表 由图３可知：温度小于９０℃时，多糖提取量 随温度的增加而增加，但温度大于９０￣Ｃ后，温度增 加，多糖提取量下降，９０℃时多糖提取量最高。 ２．２正交试验 表２实验数据分析表 １６ 第４期 赵声兰，等：猪牙皂多糖提取工艺及体外抗氧化活性的研究 极差Ｒ值反映了各因素对指标影响的大小， ４和图５。 表２试验结果表明，极差Ｒ ＞Ｒ ＞Ｒ ，说明料液 比对猪牙皂多糖提取量的影响最大，其次是提取温 度和提取时间，适宜的提取工艺条件为Ａ Ｂ Ｃ ， 即料液比为１－２５、温度为９Ｏ℃、时间为６０ｍｉｎ。 方差分析表明料液比、提取温度、提取时问对猪牙 皂多糖提取量均具有显著性影响。 ２．３猪牙皂多糖清除超氧自由基的测定 称取猪牙皂原料２００ ｇ，按上述适宜的提取工 艺条件进行加热回流提取，过滤，提取液用旋转蒸 发器浓缩至一定体积，加入３倍体积的９５％乙醇， 密封，静置过夜，离心后得多糖沉淀。多糖沉淀复 溶，经Ｓｅｖａｇｅ法 脱蛋白３次，冷冻干燥得猪牙 皂多糖。采用凯氏定氮法 测得该猪牙皂多糖含 蛋白质０．９８７ ２％． 以维生素Ｃ为阳性对照，采用邻苯三酚自氧 化法 Ｊ，测定猪牙皂多糖对超氧自由基的清除率。 邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，释放出超氧阴 离子自由基（０ ・）与中间物，中间物与超氧阴 离子自由基（０卜・）反应形成在３２５ｎｍ波长下有 特征吸收的中间产物，引起３２５ｎｍ波长处吸光值 的积累。邻苯三酚的氧化速率依赖于自氧化产生的 Ｏ 浓度，当有抑制剂存在时，可清除超氧阴离 子，阻止中间产物的积累，３２５ｎｍ波长处吸光值的 增量减少，根据吸光度数值的变化可求出待测样品 的抗氧化活性。 在１０ｍＬ具塞试管中依次加人１．５ｍＬ １５ｒｅｔｏｏｌ／ Ｌ ｐＨ值８．２的Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ缓冲液，１．５ｍＬ蒸馏水， ２５ｑＣ恒温２０ｍｉｎ后，立即加人２５℃预热的３ｍｍｏｌ／Ｌ 邻苯三酚溶液０．５ｍＬ，迅速混匀，在３２５ｎｍ处每 隔３０ｓ测定１次溶液的吸光度，计算线性范围内每 分钟吸光度的增值，即邻苯三酚的自氧化速率 △Ａ对照。 测定待测样品的抗氧化活性时，加入邻苯三酚 前，先加入一定量的待测样品溶液，同时减少同体 积的蒸馏水，其余操作同上，得△Ａ样品。结果见图 清除率＝些 ×１０。％ ＼腓 磐 ∞眈 ∞ 的弘 ｔ＼Ｓ 图４猪牙皂多糖抗超氧自由基的活性 ０ １ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ 浓度／ｐ ８／１１１１ 图５猪牙皂多糖对超氧自由基的清除率 由图４和图５可知，猪牙皂多糖对超氧自由基 具有较强的抗超氧自由基活性，清除５０％超氧自 由基时的多糖浓度ＣＣ５０为０．９ｔｘｇ／ｍＬ。 ２．４猪牙皂多糖体外清除羟自由基（・ＯＨ）的 测定［ 圳］ 采用Ｈ Ｏ ／Ｆｅ体系法。Ｆｅｎｔｏｎ反应产生羟自 由基（・ＯＨ）体系中，邻二氮菲与Ｆｅ¨反应生成 Ｆｅ¨一邻二氮菲配合物，该配合物在５３６ｎｍ有最 大吸收。当・ＯＨ氧化Ｆｅ“一邻二氮菲成Ｆｅ¨一邻 二氮菲时，使Ａ ， 减小。若反应体系中存在・ＯＨ 清除剂，氧化过程受到抑制，Ａ ， 减小不明显， 通过Ａ ， 值比较，可测定待测样品清除・ＯＨ的 １７ ２０１０仨 云南中医学院学报 第３３卷 活性。 由表４可知，猪牙皂多糖对羟自由基（・ＯＨ） 取７支试管，分别加入浓度为７．５ｍｍｏｌ／Ｌ的 具有明显的清除作用，ＣＣ 。＝１．７４０８ｍｇ／ｍＬ。 ＦｅＳＯ １ｍＬ，取其中２支试管分别作为损伤管和未 ［参考文献】 损伤管，另外５支试管中分别加人３ｍｇ／ｍＬ的多糖 ［１］高峥贞，夏玉凤，王强，等．猪牙皂的化合成分和药 溶液１．０，１．２，１．４，１．６，１．８ ｍＬ和０．０１％Ｈ２０２ 理活性研究进展［Ｊ］．中国野生植物资源，２００８，２７ １．０ ｍＬ，损伤管和未损伤管不加糖液，未损伤管 （１）：１—４． 不加Ｈ ０ ，用蒸馏水补足体积，３７￣Ｃ保温１ｈ，测 ［２］丁诸俊，许娜，风先哲，等．药百合多糖的提取工艺 定５３６ｎｍ处的吸光值，平行测定３次。配置相同 研究［Ｊ］．中国林副特产，２００９，（１）：１５—１７． ［３］高英春，陈钧．山药粗多糖脱蛋白的方法对比研究 浓度的Ｖｃ作为对照。 ［Ｊ］．２００９，３４（６）：７１—７４． ＾ ＾ ・０Ｈ的清除率＝１一 ×１００％ ［４］蔡凌云，黎云祥，陈蕉，等．白筋多糖的提取工艺和 ＾０一Ａ１ 含量比较［Ｊ］．光谱实验室，２００９，（２）：２５１—２５７． 式中： 一损伤管的吸光度；Ａ 一未损伤管的吸光 ［５］ＧＢ／Ｔ５００９．５食品中蛋白质的测定［ｓ］． 度；Ａ 一加人多糖的吸光度。结果见表４。 ［６］张泽庆，田应娟，张静．防风多糖的抗氧化活性研究 表４猪牙皂多糖对羟自由基（・ｏＨ）的清除 ［Ｊ］．中药材，２００８，３１（２）：２６８—２７２． 多糖・［７］赵选民．实验设计方法［Ｍ］．北京：科学出版社， ． ／ｍｇ・ｍＬ一 １ ２ ３ 平均 ＯＨ的清除率＝ ２ｏ０６． 一［８］包怡红，秦蕾，王戈．沙棘叶多糖的提取工艺及氧化 未损伤管０．２５３ ０．２４８ ０．３０１ ０．２６７ 等 ×１００％ 作用的研究［Ｊ］．食品工业科技，２０１０，１（３１）： ０（损伤管）０．１０４ ０．１０５ ０．１０９ ０．１０６ ０ ２８６—２９０． ０．５ Ｏ．１３ ０．１１９ ０．１２１ ０．１２３ １０．５６ ［９］赵丰丽，张云鸽，宁良丹．红菇多糖的提取分离及其 １．０ ０．１５７ ０．１５８ ０．１６２ ０．１５９ ３２．９２ 抗氧化活性的研究［Ｊ］．中国酿造，２００９，１１：９８— １．５ ０．１７９ ０．１８１ ０．１７６ ０．１７９ １０１． ４５．３４ ［１０］白伟芳，崔波．玫瑰花多糖提取及抗氧化活性研究 ２．０ ０．１９６ ０．２０８ ０．２ｏ４ ０．２０３ ６０．２５ ［Ｊ］．提取与活性，２００９，６（２５）：８３—８６． ２．５ ０．２１９ ０．２１ ０．２ｌ８ ０．２１６ ６８．３２ （编辑：迟越） ３．０ ０．２１９ ０．２３ ０．２２１ ０．２２３ ７２．６７ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉ—－ｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｒｕｃｔｕｓ Ｇｌｅｄｉｔｓｉａｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｓ Ｐｅｒｉｃａｒｐ ＺＨＡＯ Ｓｈｅｎｇ—ｌａｎ，ＣＨＥＮ Ｊｉｎ—ｗｅｉ，ＬＩＵ Ｆａｎｇ，ＬＵＯ Ｌｉ—ｍｅｉ，ＬＩ Ｓｈｉ—ｑｉ，ＹＵ Ｓｈｉ—ｊｉ （Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＴＣＭ，Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｙｕｎｎａｎ ６５０５００） ［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｒｉｃａｒｐ Ｐｏｌｙｓａｃ－ ｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｒｕｃｔｕｓ Ｇｌｅｄｉｔｓｉａｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔｓ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｒｕｃｔｕｓ Ｇｌｅｄｉｔｓｉａｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｓ ｐｅｒｉｃａｒｐ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｒａｗ ｍａｔｅ— ｉｒａｌｓ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｔｉｍｅ．Ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｅｎｔｏｎ ｒｅａｃ－ ｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔ：Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｔｏ ｓｏｌｖａｎｔ １：２５（ｗ／ｖ），９０℃ｆ０ｒ ６０ ｍｉｎｕｔｅｓ．Ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｃｌｅａｒ ５０％０ 一・ｉｓ ０．９￣ｇ／ｍｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｃｌｅａｒ ５０％・ＯＨ ｉｓ １．７４ｍｇ／ｍ１．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｐｅｒｉｃａｒｐ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａ・ ｉｔｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｇｌｅｄｉｔｓｉａｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｓ ａｐｐｅａｒ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ． ［ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ］Ｆｒｕｃｔｕｓ Ｇｌｅｄｉｔｓｉａｅ ａｂｎｏｒｍａｌｉｓ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒ－ ｉｍｅｎｔ：ａｎｔｉ—ｏｘｉｄａｔｉｏｎ １８